蒙山牛肝菌液体发酵培养基的优化

徐晓蝶， 牟敏捷， 朱婷婷， 邱国良， 郝继伟

(临沂大学生命科学学院，山东临沂 276000)



蒙山牛肝菌液体发酵培养基的优化

徐晓蝶， 牟敏捷， 朱婷婷， 邱国良， 郝继伟*

(临沂大学生命科学学院，山东临沂 276000)

[目的] 优化蒙山牛肝菌液体发酵培养基。[方法] 以菌丝干重为指标，首先采用单因素试验筛选适于菌丝体生长的最佳碳氮源，再以正交试验优化碳源与氮源以及无机盐与VB1的最佳配比。[结果] 蒙山野生牛肝菌优化的液体培养基配方为乳糖10 g/L，可溶性淀粉20 g/L，酵母膏5 g/L，牛肉膏10 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L。[结论] 正交设计法优化的蒙山牛肝菌液体发酵培养基具有一定的应用价值，可为大规模发酵生产及后继研究提供基础数据。

正交设计；牛肝菌；液体培养基

牛肝菌(Boletussp) 是一种菌根真菌，通常与松树的树根形成共生菌根，属担子菌亚门层菌纲伞菌目牛肝菌科[1]。全世界范围内已确定的牛肝菌属共有130多种，在我国可食用的有31种[2]。蒙山牛肝菌是生长在沂蒙山区山林中的一类野生牛肝菌，具有独特的风味和极高的营养价值，深受当地人们的喜爱，作为一种药用真菌具有很大的商业开发潜力。

牛肝菌作为一种菌根真菌，目前尚不能人工栽培，但其液体发酵培养菌丝的营养成分和其子实体的营养成分基本一致，通过液体发酵培养牛肝菌将是未来研究的趋势[3]。笔者利用正交设计法，对野生蒙山牛肝菌液体发酵培养基中的主要成分进行优化，以期为大规模发酵生产及后继研究提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌种。蒙山野生牛肝菌鲜菇采自蒙山。

1.1.2 仪器设备。SW-CJ超净工作台，高压灭菌锅，DGG-9075A型电热恒温鼓风干燥箱，SPX-250B-Z 型生化培养箱，EO2140型分析天平，DKY2型恒温培养摇床，电磁炉。

1.1.3 培养基。①母种培养基：马铃薯(去皮)200 g，蔗糖20 g，麸皮30 g(煮汁)，VB10.5 g，KH2PO42 g，MgSO4·7H2O 1 g，琼脂20 g，水1 000 ml。②液体菌种基础培养基：蛋白胨3 g/L，葡萄糖20 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，VB10.5 g/L。③碳源优化培养基：以液体菌种基础培养基中葡萄糖作对照，分别用乳糖20 g/L、麦芽糖20 g/L、蔗糖20 g/L、可溶性淀粉20 g/L、甘露醇20 g/L代替葡萄糖。④氮源优化培养基：以液体菌种基础培养基中蛋白胨作对照，分别用酵母膏10 g/L、牛肉膏10 g/L、(NH4)2SO410 g/L、豆粕10 g/L代替蛋白胨。

1.2 试验方法

1.2.1 斜面菌种制备。母种培养基灭菌后摆成斜面，在无菌条件下采用组织块法将牛肝菌鲜菇接种到斜面培养基中部，然后置于25 ℃下培养15 d左右，即可得到蒙山牛肝菌的斜面菌种。挑选无污染、健壮的菌种备用。

1.2.2 液体菌种制备。液体菌种基础培养基按配方配制好后，按每瓶150 ml倒入干净的250 ml三角瓶中，用透气封口膜封口并用牛皮纸包裹瓶口，于121 ℃下灭菌20 min。冷却后，取0.5～1.0 cm2的母种块接入液体菌种。先25 ℃下静置培养2 d，然后120 r/min振荡培养6 d，在瓶中即可看到大量菌球形成。

1.2.3 发酵试验。无菌条件下用灭过菌的玻棒破碎液体菌种的菌球，然后按10%(V/V)的接种量用无菌吸管吸取液体菌种，接种于灭菌后的相应液体培养基中，在25 ℃、120 r/min的条件下振荡培养3 d。

1.2.4 菌丝重量测定。发酵试验后通过观察剔除污染的试验处理，如果由于污染影响到试验结果的分析，需要补充相关试验。将无污染三角瓶中的菌体与培养液的混合物置于80 目网筛上过筛，通过蒸馏水洗涤后，置于80 ℃干燥箱内干燥至恒重，称重。

2 结果与分析

2.1 不同碳源对菌丝生长量的影响

从图1可以看出，蒙山牛肝菌在乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露醇6种培养基中都能生长。其中以乳糖、可溶性淀粉作碳源时，菌丝产量最高，所以选用乳糖、可溶性淀粉作为正交试验的碳源因子。

2.2 不同氮源对菌丝生长量的影响

从图2可以看出，蒙山牛肝菌对酵母膏、牛肉膏的利用效果较好，且二者的菌丝产量接近，但对铵盐的利用效果较差，所以采用酵母膏、牛肉膏作为正交试验的氮源因子。

2.3 碳氮源组合的优化

碳氮源组合优化基础培养基为KH2PO41 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、VB10.5 g/L。根据单因素试验的结果，在基础培养基内添加不同浓度的乳糖和可溶性淀粉作为碳源，添加不同浓度的酵母膏和牛肉膏作为氮源，采用L9(34)正交试验来确定碳氮源的最佳组合。试验因素及水平见表1，并设3次重复。通过测定菌丝干重来确定碳氮源的最佳组合。

表1 碳氮源正交试验的因素与水平 g/L

正交试验结果见表2。对表2结果进行方差分析，结果表明，乳糖(A)与酵母膏(C)对试验结果并无显著影响(P>0.05)；而可溶性淀粉(B)与牛肉膏(D)对试验结果有极显著影响(P<0.01)，进一步结合表2极差分析结果R(B)>R(D)>R(A)>R(C)，可知4因素对试验结果影响大小依次为可溶性淀粉、牛肉膏、乳糖、酵母膏。

由表2可知，处理A2B2C3D3菌丝干重最大，A3B2C1D2与A2B2C3D3无显著差异，则二者均为最好水平组合。但从极差分析结果可知，A2B2C2D2应为最佳水平组合，该组合在正交试验表中并未出现，需要作验证试验进行确认。验证试验结果表明，菌丝干重平均值为22.4 g/L，高于其他两组合，但并无显著差异。因此，A2B2C2D2虽为该试验最佳水平组合，但由于乳糖与酵母膏对试验结果无显著影响，因此建议生产中因降低生产成本的需要可采用的最佳碳氮源组合为A1B2C1D2，即乳糖10 g/L，可溶性淀粉20 g/L，酵母膏5 g/L，牛肉膏10 g/L。

表2 碳氮源正交试验结果

注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2.4 无机盐及维生素的优化

以碳氮源最佳组合即乳糖10 g/L、可溶性淀粉20 g/L、酵母膏5 g/L、牛肉膏10 g/L为供试基础培养基。在培养基内分别添加不同浓度的KH2PO4、MgSO4·7H2O、VB1，采用L9(34)正交试验确定无机盐与维生素的最佳配比，试验因素及水平见表3，并设3次重复。通过测定菌丝干重来确定无机盐与维生素的最佳配比。

表3 无机盐及维生素正交试验因素与水平 g/L

正交试验结果见表4。对表4试验结果进行方差分析，结果表明，KH2PO4(A)与MgSO4·7H2O(B)对试验结果有极显著影响(P<0.05)；而VB1(C)对试验结果无显著影响(P>0.05)，进一步结合表4极差分析结果R(A)>R(B)>R(C)，可知3因素对试验结果影响大小依次为KH2PO4、MgSO4·7H2O、VB1。

由表4可知，处理A2B2C3菌丝干重最大，与A2B1C1、A1B2C2和A2B3C2间无显著差异，但从极差分析结果可知，A2B2C2应为最佳水平组合，该组合在正交试验表中并未出现，需要作验证试验进行确认。验证试验结果表明，菌丝干重平均值为22.8 g/L，与A2B2C3相近。考虑到VB1(C)对试验结果无显著影响，因此建议生产中采用的无机盐及维生素组合为A2B2C1，即KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L。

表4 无机盐及维生素正交试验结果

注:同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

3 结论与讨论

该研究表明，蒙山野生牛肝菌液体培养基最佳配方为乳糖10 g/L，可溶性淀粉20 g/L，酵母膏5 g/L，牛肉膏10 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L,与张扬等[4]对红绒盖牛肝菌的研究、郭永月等[5]对黑牛肝菌的研究、冮洁等[6]对美味牛肝菌的研究略有差别，主要原因为牛肝菌品种不同。但以上研究中有一共同点，即其配方中的碳氮源均为有机的，由此可见牛肝菌在液体培养中对营养物质的需求较全面。

在通过正交设计法优化培养基的过程中，多数人单纯根据极差法得到最佳组合[4]，往往得出的结论较片面化、理论化。而极差法与方差分析法相结合得到的结论更加合理、应用性更强。该试验中得出的最佳配方为乳糖10 g/L，可溶性淀粉20 g/L，酵母膏5 g/L，牛肉膏10 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，相较于单纯根据极差法得到的结论可以减少非显著因素的用量，在生产上可节约生产成本，提高一定的经济效益。

[1] 茆晓岚.中国经济真菌[M].北京:科学出版社,1998:328.

[2] 李泰辉，宋斌．中国食用牛肝菌的种类及其分布[J]．食用菌学报，2002，9(2)：22-30.

[3] 邵力平，沈瑞祥，张素轩，等.真菌分类学[M].北京：中国林业出版社，1984：247-278.

[4] 张扬，赵阳，范克胜，等．红绒盖牛肝菌发酵培养基筛选及液体培养条件[J]．林业科技开发，2013，27(4)：111-114.

[5] 郭永月，陶明煊，周斌，等．黑牛肝菌液体发酵条件的优化[J]．食品工业科技，2012，33(9)：183-186.

[6] 冮洁，张茜.美味牛肝菌液体培养及其在酱油生产中的应用[J]．食品工业科技，2009，30(7)：223-226.

The Optimization of Liquid Fermentation Medium of Mengshan Mountain Boletus

XU Xiao-die, MU Min-jie, ZHU Ting-ting, HAO Ji-wei*et al

(College of Life Science, Linyin Normal University, Linyi, Shandong 276000)

[Objective] The aim was to optimize liquid fermentation medium of Mengshan mountain boletus. [Method] Adopting mycelial dry of Mengshan mountain boletus as major index, firstly the single factor method was used to select the best carbon source and nitrogen source for mycelium growth, and then the optimum ratio of carbon source, nitrogen source, inorganic salt and VB1was optimized by the orthogonal experiment. [Result] The optional liquid fermentation medium of Mengshan mountain boletus were as follow: lactose of 10 g/L，soluble starch of 20 g/L, yeast extract of 5 g/L, beef paste of 10 g/L, KH2PO4of 1 g/L，MgSO4·7H2O of 1 g/L. [Conclusion] The optimized liquid fermentation culture medium of Mengshan mountain boletus by the orthogonal design has a certain application value, and can provide the basic data for large-scale fermentation and subsequent research.

Orthogonal design; Boletus;Liquid fermentation medium

国家级大学生创业创新训练计划资助项目。

徐晓蝶(1997- )，女，安徽亳州人，本科生，专业：生物科学。*通讯作者，副教授，从事食药真菌开发利用及野生资源保护方面的研究。

2015-10-20

S 336

A

0517-6611(2015)35-241-02