蛋白吸附蓝莓花青素颗粒对其单体的稳定性和抗氧化活性研究

林晓玲，刘晨楠，张 昕，张笑晨，王嘉悦，陈 健

(1．北京林业大学生物科学与技术学院食品科学与工程系，北京100083;

2．北京林业大学林业食品加工与安全北京市重点实验室，北京100083)

牛血清白蛋白(BSA)是血浆中能与许多內源及外源化合物发生可逆的非共价结合的载体蛋白，它能够发挥重要的储存和转运作用［1］。由于样品纯度高且廉价易获得，目前已经作为一种常见的模型蛋白载体，用于结合具有生物活性的小分子。据报道，花青素主要与BSA中的色氨酸残基以静电引力的形式发生相互作用［2］。

蓝莓中花青素的提取物以矢车菊素为主［3－4］，属于类黄酮类化合物，基本结构为α-苯基苯并吡喃型阳离子。已报道的花青素具有抗炎、抗动脉粥样硬化、抗血糖升高、肝细胞保护、改善视力、癌细胞生长抑制等作用［3，5］108－112。因此，花青素被广泛用于功能食品成分制剂和功能食品生产中。但花青素的多羟基水溶性限制了它在脂类产品中的应用，其活泼酚羟基易被氧化成醌类物质［6］，使其生物活性降低。另外，受加工储藏中一些理化因素如温度、光照以及添加剂等的影响，使得花青素在食品加工过程中的稳定性较差。而蛋白大分子与类黄酮化合物的结合，可以减缓类黄酮化合物的氧化进程，起到保护类黄酮化合物的作用［7］。姚惠芳等的研究表明，在磷酸盐缓冲液(pH 7．4)中，BSA与花青素通过自组装形成颗粒，在肠模拟体系中BSA与花青素结合对花青素有明显的保护作用［8］(1－6)。在此基础上，通过评价BSA-花青素颗粒在不同环境因素中对花青素的稳定性及其在不同体系中的抗氧化性能，有利于指导BSA-花青素颗粒在食品中的应用。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 原料及试剂。蓝莓鲜果购于辽宁丹东市有机食品有限公司，－80℃冷冻保存;牛血清白蛋白(BSA，纯度大于98%，分子质量68 000 D)，美国Amresco公司进口分装;Amberlite XAD-7大孔树脂，天津南开大学化工厂;色谱级甲醇，购于 Fisher公司;10×PBS(pH 7．2～7．4)，购于北京索莱宝科技有限公司;Trolox(6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid)，购于上海叶舟生物科技有限公司;TFA、柠檬酸、柠檬酸钠，国药集团化学试剂有限公司;甲醇、氯化钾、硫酸亚铁、氯化铁、葡萄糖、蔗糖、抗坏血酸、磷酸氢二钾、醋酸钠、亚硫酸钠、盐酸、过氧化氢，北京化工厂;以上化学试剂除特殊说明外均为分析纯;所用水均为蒸馏水。

1．1．2 主要仪器。Amberlite XAD-7层析柱(26 mm×70 cm);AL 104型电子天平，梅特勒－托利多仪器有限公司;RE2010旋转蒸发仪，上海卫凯仪器设备有限公司;QL-901旋涡混合仪，海门市其林贝尔仪器制造有限公司;电子恒温水浴锅，北京卓川电子科技有限公司;T6新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司;恒温摇床，上海天呈实验仪器制造有限公司。

1．2 方法

1．2．1 样品预处理。

1．2．1．1 矢车菊素-3-葡萄糖苷的制备。参照陈健的方法［9］:在0℃下用含0．5%TFA的甲醇浸提破碎好的蓝莓鲜果24 h，取离心后的上清液在38℃下旋转蒸发后得到蓝莓花色苷提取物的浓缩液。将浓缩液和乙酸乙酯以1∶1(V∶V)的比例进行3次萃取，得到蓝莓花色苷样品。再用Amberlite XAD-7柱色谱进行粗分离，最后经制备型高效液相色谱制备出蓝莓花青素主要单体Cy-3-glu。

1．2．1．2 蛋白载体的制备。牛血清白蛋白用0．1 mol/L PBS(pH 7．4)配制成1．5×10－4mol/L的储备液，置于4 ℃的冰箱保存;提取得到的蓝莓花青素单体Cy-3-glu用去离子水(pH=6．3)配成3．0×10－3mol/L 储备液。根据姚惠芳等的研究，BSA与花青素的摩尔浓度比为1∶20时，BSA纳米载体对花青素的结合达到饱和［8］(1－6)。在 pH 7．4 的 PBS 缓冲体系中，BSA与花青素按照1∶1体积比添加，满足BSA与花青素的浓度比为1∶20。用旋涡混合仪混合均匀，静置得到Cy-3-glu颗粒。

1．2．2 检测方法。

1．2．2．1 未吸附蓝莓花青素的检测方法［10－11］。pH 1．0 的缓冲液的配制:将0．02 mol/L KCl溶液与0．02 mol/L HCl溶液以25∶67 的比例混合，用KCl溶液调节溶液pH(1．0 ±0．1)。

pH 4．5 的缓冲液的配制:将 1 mol/L NaAc、1 mol/L HCl与 H2O 以100∶60∶90 的比例配制，用盐酸调 pH(4．5 ±0．1)。

采用pH示差法，分别取1 ml待测样品于反应容器中，往里各加入9 ml pH为1．0、4．5的缓冲液，40℃水浴平衡40 min后在520 nm波长下分别测定吸光度，记作A0、A0′并按照下列公式计算:

花青素含量(C，mg/L)=(A×MW)/(Σ×1)×Df×1 000保存率(%)=C2/C1×100

式中，A=A0－A0′;C1、C2分别为处理前后花青素含量;MW为矢车菊素-3-葡萄糖苷的相对分子质量(449．2);Σ为摩尔消光系数;Df为稀释因子(样品总的稀释倍数)。

由于MW、Df和Σ在同一样品处理时是一致的，故保存率可以简化为:

保存率(%)=A2/A1×100

式中，A1、A2分别为处理前、后的蓝莓花青素在pH 1．0和pH 4．5缓冲液下测定的吸光值之差。

1．2．2．2 吸附后颗粒中蓝莓花青素的检测方法。参照方茹等的试验方法［6］(108－112)，用 NaOH 将0．68%K2HPO4调至 pH 7．4，吸附后的颗粒在该中性体系下，在 528 nm［8］(1－6)波长下测定吸光值，并计算保存率。

保存率=A4/A3×100

式中，A3、A4分别为处理前、后的Cy-3-glu颗粒的吸光值。

1．2．3 不同条件对吸附后蓝莓花青素的稳定性影响。

1．2．3．1 Cy-3-glu颗粒的热稳定性。分别取3份40 ml制备好的Cy-3-glu颗粒溶液放入40、60、80℃的水浴锅中，每隔2 h测定其含量变化。对照组取等量未经过吸附的蓝莓花青素溶液进行相同处理，同样测定其含量变化。按照同样方法进行3次独立重复试验。

1．2．3．2 Cy-3-glu颗粒的光稳定性。分别取2份40 ml制备好的Cy-3-glu颗粒溶液，一份置于棕色试剂瓶并避光保存，另一份置于白色试剂瓶在自然光条件下储存，每隔2 d测定其含量变化。对照组取等量未经过吸附的蓝莓花青素溶液进行相同处理，同样测定其含量变化。按照同样方法进行3次独立重复试验。

1．2．3．3 添加剂对Cy-3-glu颗粒的稳定性影响。取制备好的Cy-3-glu颗粒溶液各30 ml，分别加入等量不同质量浓度的VC、葡萄糖和蔗糖，对照组加入等量的蒸馏水。置于37℃，100 r/min摇床中，每隔2 h测定其含量变化。按照同样方法进行3次独立重复试验。

1．2．3．4 氧化还原剂对Cy-3-glu颗粒的稳定性影响。分别取2份制备好的Cy-3-glu颗粒溶液各30 ml，分别加入质量分数比为20%的过氧化氢和5%的亚硫酸钠。对照组取等量未经过吸附的蓝莓花青素进行相同处理，置于37℃，100 r/min摇床中，每隔2 h测定其含量变化。按照同样方法进行3次独立重复试验。

1．2．4 蛋白吸附对Cy-3-glu的抗氧化性能影响。

1．2．4．1 清除羟基自由基(·OH)能力［12－13］。用 95% 乙醇配制0．05%的溴甲酚紫溶液;用重蒸水配制1 mmol/ml Fe-SO4以及0．1 mol/L H2O2。将 0．4 ml 0．05% 的溴甲酚紫溶液、0．5 ml 0．1 mol/L HCl和 1．0 ml 1．0 mmol/L FeSO4溶液分别加入到试管中，稀释至刻度并摇匀，在30℃下反应8 min。按照上述方法重复试验3次，在波长420 nm处测定溶液的吸光值，取平均值记作为A0。按照上述加样方法，补充添加0．5 ml 0．1 mol/L H2O2，稀释至刻度后摇匀。同样测定其吸光值记作A。

Cy-3-glu清除·OH的测定:按照同样加样方法，在加入0．5 ml 0．1 mol/L H2O2后，再分别加入经蛋白吸附和未经蛋白吸附的Cy-3-glu，稀释至刻度摇匀后在同样条件下测定其吸光值，记作AS。则Cy-3-glu对·OH的清除率为:

D(%)=(AS－A)/(A0－A)×100

1．2．4．2 铁还原力测定。采用孙建霞的方法［14］，配制由2.5 ml 10．0 mmol/L 的 TPTZ 溶液，2．5 ml 20．0 mmol/L 的FeCl3和25．0 ml 0．3 mol/L醋酸盐缓冲液组成的TPTZ工作液。用0.5%TFA 水和甲醇(7∶3，V/V)配制浓度为25、50、100、200、400和600 mmol/L的 Trolox标准溶液，各取 40 μl与TPTZ工作液反应30 min后，用分光光度计在波长593 nm处测定其吸光值，并制作标准曲线。

取吸附的Cy-3-glu与未吸附的Cy-3-glu，各稀释10倍至40μl，与260μl TPTZ工作液分别在弱光、中等光强和强光下反应30 min后，用分光光度计在波长593 nm处测定其吸光值。以相当于 nmol/ml Trolox(6-Hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid)的铁还原能力来表示Cy-3-glu的铁还原能力。

2 结果与分析

2．1 温度对吸附前后Cy-3-glu的稳定性影响 由图1～3可知，随着温度的升高和时间的迁移，吸附前后的Cy-3-glu的保存率均呈现下降趋势，并且温度越高，保存率的下降幅度越大。在40℃和60℃加热2 h后，未吸附的Cy-3-glu保存率的下降速率明显高于吸附后的Cy-3-glu，说明吸附后的Cy-3-glu耐热性提高。80℃时吸附前后Cy-3-glu保存率的下降趋势与速率基本一致。由于蛋白对花青素稳定性的提高与两者之间的分子间氢键有关，氢键结合作用越强，蛋白对花青素保护越明显［9］，由于在80℃时BSA变性，导致蛋白质与花青素间的氢键断裂，蛋白质不能有效地保护被吸附的花青素。在40℃和60℃加热10 h后，吸附后的Cy-3-glu的保存率分别为90．97%和72．59%，高于未吸附的Cy-3-glu，说明在一定温度范围内，蛋白吸附能使Cy-3-glu的热稳定性提高。

2．2 光照对吸附前后Cy-3-glu的稳定性影响

2．2．1 黑暗储存。由图4、5可看出，随着时间的推移，Cy-3-glu的保存率呈下降趋势，吸附与未吸附的Cy-3-glu避光储存的保存率显著高于在自然光照下储存的保存率，说明光照对蓝莓花青素有显著影响(P＜0．05)。李颖畅等研究也表明，光照能降解蓝莓提取液中的花青素，并导致其不稳定［15］。10 d，自然光处理下蛋白吸附花青素的保存率和未吸附的保存率分别为78．1%和45．5%;黑暗处理两者的保存率分别为88．4%和78．5%。可见，蛋白吸附能够提高Cy-3-glu的保存率，使其在不同的光照条件下处于一个相对稳定的态势。

2．3 添加剂对Cy-3-glu颗粒中Cy-3-glu稳定性的影响

2．3．1 VC对Cy-3-glu颗粒中Cy-3-glu稳定性的影响。研究表明，VC在有氧条件下，被分解产生过氧化氢会影响花青素的稳定性［16］。由图6可看出，VC添加量为0．10%与0．25%对吸附后Cy-3-glu的保存率的影响在10 h内大致相同。0.50%的添加量相对于其他浓度的添加量能够显著提高吸附后Cy-3-glu的保存率，但当添加量达到1．00%时，吸附后Cy-3-glu降解加速。与对照组相比，由于VC具有抗氧化功能，使得不同浓度的VC能够提高吸附后Cy-3-glu的保存率，10 h吸附后的花青素的保存率均在87%左右。添加不同浓度的VC对吸附后Cy-3-glu影响没有显著性差异(P＞0．05)，说明添加适量VC可以增加吸附后Cy-3-glu的稳定性。

2．3．2 葡萄糖对Cy-3-glu颗粒中Cy-3-glu稳定性的影响。由图7可知，当葡萄糖的添加质量分数为5%时，在前5 h使花青素的保存率小幅下降，说明低浓度葡萄糖对吸附后Cy-3-glu的稳定性影响不大。在该试验中，与对照组相比吸附后Cy-3-glu的保存率随着所添加的葡萄糖浓度的增大而增大，当葡萄糖添加量达到30%时，吸附后Cy-3-glu的保存率在91%以上。由于添加不同浓度的葡萄糖对吸附后Cy-3-glu影响没有显著性差异(P＞0．05)，说明添加适量葡萄糖可以增加吸附后Cy-3-glu的稳定性。

2．3．3 蔗糖对Cy-3-glu颗粒中Cy-3-glu稳定性的影响。由图8可看出，相对于对照组，随着蔗糖浓度的增大，吸附后Cy-3-glu保存率总体呈上升的趋势。何玲等认为，蔗糖对红提、葡萄有一定的增色作用［17］。而在该试验条件下，当蔗糖浓度达到20%时，10 h后吸附后Cy-3-glu的保存率最大并达到92．8%。高浓度(30%)的蔗糖溶液对吸附后Cy-3-glu的影响与5%的大致相同，保存率反而不存在上升趋势。由于添加不同浓度的蔗糖对吸附后Cy-3-glu影响没有显著性差异(P＞0．05)，说明添加适量蔗糖与葡萄糖同样可以增加吸附后Cy-3-glu的稳定性。

2．4 氧化还原剂对Cy-3-glu颗粒中Cy-3-glu的稳定性影响

2．4．1 过氧化氢对吸附前后Cy-3-glu的影响。由图9可看出，质量分数为20%过氧化氢对花青素的影响显著，10 h后吸附与未吸附的Cy-3-glu保存率均下降到35%以下。由于过氧化氢作为强还原剂，能与Cy-3-glu明显反应使颜色变浅。但添加相同浓度的过氧化氢，未吸附的Cy-3-glu比已吸附的Cy-3-glu保存率下降的趋势更快。因此，吸附后的Cy-3-glu对强还原剂的稳定性提高。

2．4．2 亚硫酸钠对吸附前后Cy-3-glu的影响。由图10看出，在中性条件下，质量分数为5%亚硫酸钠对花青素影响比较明显，10 h后吸附与未吸附的花青素保存率均明显下降。由于亚硫酸钠作为强氧化剂，与花青素反应明显，反应物颜色浅。吸附后的Cy-3-glu，花青素与BSA通过静电引力紧密结合在一起［8］(1－6)，被亚硫酸漂白的机率下降。而未经过吸附的Cy-3-glu保存率下降更明显，10 h后保存率不到35%。可见，吸附后Cy-3-glu对强氧化剂的稳定性提高。

2．5 Cy-3-glu的抗氧化性能

2．5．1 清除羟基自由基(·OH)的能力。由图11可看出，吸附前后的Cy-3-glu均有较强的清除自由基的能力，并且清除能力随着Cy-3-glu浓度的增大而增强。当蛋白与花青素的浓度比相同时，吸附后的颗粒对·OH的清除率高于未吸附的Cy-3-glu，说明颗粒能较好地使Cy-3-glu的酚羟基基团发挥抗氧化的作用，使其抗氧化能力增强。

2．6．2 铁还原力。

2．6．2．1 铁还原力标准曲线的测定。将平行测定结果平均值进行线性回归，作出铁还原力标准曲线。其线性回归方程为:Y=3．7E －5x+0．015 3，R2=0．991 1。

2．6．2．2 Cy-3-glu的铁还原力测定。由图13～15可看出，在以抗坏血酸为参照的情况下，随着光照强度的增强，吸附与未吸附的Cy-3-glu对铁的还原力均增强，并且随着Cy-3-glu浓度的增大，两者对铁的还原力也逐渐增强。在不同的光照条件下，吸附后的Cy-3-glu对铁的还原力均高于未吸附的Cy-3-glu，并且均在蛋白与花青素浓度为1∶30处达到最高:弱光条件下相当于3 280 nmol/L Trolox溶液对铁的还原力，中等光强下相当于10 397 nmol/L Trolox溶液对铁的还原力，强光条件下相当35 667 nmol/L Trolox溶液对铁的还原力，不同光照条件对吸附后蓝莓花青素影响有显著性差异(P＜0．05)，说明光照条件对Cy-3-glu对铁还原力的测定有不同的影响，Cy-3-glu颗粒能够提高花青素的抗氧化能力。

3 结论

相对于未吸附蓝莓花青素，牛血清白蛋白与蓝莓花青素结合形成的Cy-3-glu颗粒可以显著提高光、热稳定性以及对强氧化还原剂的稳定性，可以推断提高蓝莓花青素稳定性的根本原因是蛋白吸附。一定浓度的VC、蔗糖、葡萄糖和过氧化氢等可以提高Cy-3-glu颗粒的稳定性，并且Cy-3-glu颗粒对羟基自由基有较好的清除能力，在不同光照条件下对铁的还原力也比未吸附的蓝莓花青素强，具有一定的抗氧化能力。

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