响应面法优化黑木耳菌液体发酵胞外多糖条件

李 洋，宗希明，袁 寰，史伟国，李 野，王丽红，杜 娟，周 彤

(佳木斯大学药学院，黑龙江佳木斯154002)

黑木耳(Auricularia auricular)属于担子菌纲、木耳目、木耳科、木耳属，是一种药食同源的真菌类物质［1］。黑木耳含有多种成分，多糖为其重要活性成分，研究表明，黑木耳多糖具有抗衰老［2］、抗凝血［3－4］、降血糖［5］、降血脂［6］、抗肿瘤［7］、增加免疫等功能［8－9］。食用菌深层发酵技术其特点为生产周期短、产量大、质量高、经济效益突出等，在液体菌种制备、医药及保健、食品行业以及抑菌防腐等领域具有广泛用途［10］。笔者将水果皮、中药材等考察因素加入到培养基中进行试验，并应用响应面法优化黑木耳菌液体发酵胞外多糖的条件，应用苯酚－硫酸法对黑木耳菌液体发酵的胞外多糖含量进行测量，对液体发酵黑木耳菌胞外多糖具有重要意义。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 菌种。供试黑木耳菌由佳木斯大学生命科学院提供。

1．1．2 培养基。PDA培养基:马铃薯20%，琼脂3%，葡萄糖2%，pH自然。液体发酵培养基:马铃薯汁20%，KH2PO40．30%，MgSO4·7H2O 0．15%，VB10．01%，碳源 3%，氮源0．15%，水果皮4%，中药材10%，pH自然。

1．2 方法

1．2．1 PDA培养。从斜面培养基中取出菌丝块接种于PDA平板培养基中部，放置到26℃的恒温培养箱中培养，每天观察菌丝体的生长状况，及时淘汰感染杂菌的培养基。

1．2．2 液体发酵单因素试验。根据单因素试验对液体培养基进行配制并编号。无菌操作台上取出1 cm2的菌丝块接种于已经标号的无菌液体培养液中，于26℃恒温培养。分别考察碳源、氮源、水果皮、中药材对黑木耳菌液体发酵胞外多糖含量的影响。

1．2．3 响应面法优化发酵条件。在单因素试验的基础上，以黑木耳菌液体发酵胞外多糖含量为考察指标，采用响应面试验设计优化黑木耳菌液体发酵胞外多糖条件碳源、氮源、水果皮、中药材，从而获得黑木耳菌液体发酵胞外多糖的最佳条件。采用分析软件Design-Expert，设计4因素3水平的响应面分析。获得回归方程，根据多元二次回归方程，以胞外多糖为响应值，对各因素水平进行优化，得到黑木耳菌液体发酵胞外多糖的最佳发酵条件。试验因素水平见表1。

表1 黑木耳菌液体发酵胞外多糖条件响应面法试验因素水平设计

1．2．4 胞外多糖含量测定。将培养7 d后的黑木耳菌液体发酵培养液离心，取澄清培养液5 ml，加入15 ml无水乙醇，放置在4℃冰箱12 h，待沉淀析出后进行离心，得沉淀粗多糖。通过苯酚－硫酸法测得多糖的含量。

2 结果与分析

2．1 线性关系的考察 试验得出，无水葡萄糖标准品标准曲线线性方程为 y=38．314x+0．000 4，R2为 0．997 5。由此可见，无水葡萄糖标准曲线线性关系良好。

2．2 回归方程的建立 以碳源、氮源、水果皮、中药材为自变量，以黑木耳菌液体发酵胞外多糖含量为响应值进行响应面试验，试验结果见表2。将所得试验数据使用Design-Ex-pert软件分析，得到黑木耳菌液体发酵胞外多糖的二元多次回归方程为:Y=0．013+0．003 623A+0．000 739 2B+0．000 285C+0．000 688 3D －0．000 332 5AB －0．000 827 5AC+0．000 382 5AD +0．000 075BC － 0．000 765BD－0．000 102 5CD+0．002 13A2+0．001 518B2+0．001 167C2+0．001 597D2。

2．3 回归分析 通过回归模型方差分析可以看出，模型的P值为＜0．000 1，说明该模型回归显著，试验数据得到的F值说明模型的拟合性较好，模型的校正决定系数R2=0．951 9，可以用于黑木耳菌液体发酵胞外多糖的试验设计。

根据回归方程，获得碳源、氮源、水果皮与中药材响应面曲面图。由图1可见，其中A(碳源)对黑木耳菌液体发酵胞外多糖含量的影响最为明显，表现为响应面曲线较陡，B(氮源)、C(水果皮)和D(中药材)对黑木耳菌液体发酵胞外多糖含量的影响相对较弱，表现为曲线较平缓。AB(碳源与氮源的交互作用)与AC(碳源与水果皮的交互作用)对黑木耳菌液体发酵胞外多糖含量的影响较大，BD(氮源与中药材的交互作用)与CD(水果皮与中药材的交互作用)对黑木耳菌液体发酵胞外多糖含量的影响一般，AD(碳源与中药材的交互作用)、BC(氮源与水果皮的交互作用)对黑木耳菌液体发酵胞外多糖含量的影响较小。

通过黑木耳菌液体发酵胞外多糖含量的回归方程，得出黑木耳菌液体发酵胞外多糖的最佳条件为:碳源可溶性淀粉3%、氮源胰蛋白胨0．15%、水果皮莎白瓜皮4%、中药材红景天10%。在此条件下胞外多糖的最大预测值为0．025 575 7 g/ml。

表2 响应面试验设计与结果

2．4 验证试验 采用响应面获得的最优发酵条件进行黑木耳菌液体发酵试验，该条件下实际测得的多糖含量为0．024 51 g/ml，与预测值相差＜5%。可见，回归方程的预测值与试验值之间具有较好的拟合度。故采用响应面法优化黑木耳菌液体发酵胞外多糖条件准确可靠，具有实际应用价值。

3 结论

采用响应面法，可以优化黑木耳菌液体发酵胞外多糖条件，也可预测响应值，从而获得最优值。该试验采用响应面优化方法，确定黑木耳菌发酵胞外多糖的最佳发酵条件为碳源可溶性淀粉3%、氮源胰蛋白胨0．15%、水果皮莎白瓜皮4%、中药材红景天10%，在此条件下的黑木耳菌液体发酵胞外多糖含量为0．024 51 g/ml。

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