纳升级反相液相色谱－串联质谱法分析麦氏弧菌蛋白质组

李正义，贾俊涛*，姜英辉，王 骏，罗 继，崔淑华，徐 彪，梁成珠，张铁军

(1．山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，山东青岛266002;2．AB SCIEX公司上海应用实验室，上海200233)

麦氏弧菌(Vibrio metschnikovii)是国际公认的11种致病性弧菌之一，也是引起感染性腹泻的致病菌［1］，主要能引起人类的创伤性感染和败血症［2］。目前对于麦氏弧菌检测方法的研究主要集中在传统的分离鉴定和分子生物学技术等方面［3］，而对提取的麦氏弧菌蛋白进行系统分析目前未见报道。国内外研究人员主要采用二维电泳(Two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrum，MALDI-TOF MS)技术对细菌提取蛋白的酶解产物进行分析［4－5］。Khot等利用 MALDI-TOF MS技术采集志贺氏菌属和大肠杆菌的蛋白质种属生物标记物，得到15个属标记物和12个种标记物，能够高通量有效区分大肠杆菌和志贺氏菌属［6］。

纳升级反相液相色谱－串联质谱法(nano-RPLC-MS/MS)检测生物大分子具有极高的灵敏度和精确度，在生物医学领域特别是在蛋白质分析中得到了广泛的应用。Zhang等通过比较人类胃腺癌细胞与正常胃黏膜上皮细胞，利用纳升级反相液相色谱－串联质谱法鉴定78种蛋白，发现细胞系膜联蛋白A1的表达上调与人类胃腺癌密切相关［7］。于海洋等利用纳升级反相液相色谱－串联质谱法系统分析了锦灯笼果实的提取蛋白质的酶解产物，数据库检索到60种蛋白［8］。陈霞等结合聚丙烯酰胺凝胶电泳分析了蜈蚣提取蛋白质的胶内酶解和直接酶解产物，胶内酶解鉴定到72种蛋白质，直接酶解鉴定到97种蛋白质［9］。笔者引入蛋白质组学研究方法，采用了高灵敏度的纳升级反相液相色谱－串联质谱法，对分离自美国龙虾的一株麦氏弧菌提取蛋白质进行溶液内酶解，对直接酶解产物进行分析，并对鉴别到的蛋白质的生物进程、细胞组分及功能活性进行分析，较系统地研究了麦氏弧菌提取蛋白质，为麦氏弧菌蛋白质组学的深入研究奠定了基础。

1 材料与方法

1．1 材料 纳升级液相色谱系统:Eksigent NanoLC-Ultra®液相系统;高分辨质谱系统:TripleTOFTM5600+，配有电喷雾离子源(ESI)和ProteinPilot 4．5蛋白质分析软件(美国AB Sciex公司)，假阳性率控制在小于1%。

十二烷基磺酸钠(SDS)，购于SIGMA公司;乙二胺四乙酸(EDTA)、甲基磺酰氟(PMSF)，购于Amesco公司，级别为ultra pure grade;离心机为德国eppendorf centrifuge公司;牛血清蛋白(BSA)、考马斯亮蓝染料G250、蛋白分子量Marker，购于生工生物工程(上海)有限公司;二硫苏糖醇(DTT)、尿素(UREA)、碘乙酰胺(IAM)、四乙基溴化铵(TEAB)，购于Promega公司;胰蛋白酶(Trypsin，Promega质谱测序级);乙腈、甲酸等质谱用试剂均为质谱级(德国Merck公司);该试验中涉及到的其他化学试剂为分析纯。

麦氏弧菌F5-1，分离自进口美国的美国龙虾(Homarus americanus)腹部。

1．2 麦氏弧菌总蛋白的提取 麦氏弧菌在4℃，10 000 r/min，离心5 min，收集菌细胞沉淀。菌细胞置于1．5 ml离心管中，加入300μl裂解液，超声5 min。超声条件:起动时间2 s，超声间隔3 s，超声功率180 W;裂解液缓冲液的配制:8 mol/L 尿素，30 mmol/L HEPES，1 mmol/L PMSF，2 mmol/L EDTA，10 mmol/L DTT。超声后，离心30 min，取上清，加入DTT至终浓度10 mmol/L。56℃水浴1 h，取出后，迅速加入IAM至终浓度55 mmol/L，暗室静置1 h，加入4倍于样品溶液体积的预冷丙酮，－20℃沉淀3 h以上。离心30 min，取沉淀，加入700μl的复溶缓冲液，终浓度为50%TEAB，0．1%SDS。超声3 min助溶，超声条件同上。离心30 min，取上清。提取蛋白样品使用bradford法对蛋白进行定量，SDS-PAGE检测蛋白质提取情况。

1．3 麦氏弧菌蛋白质直接酶解 取麦氏弧菌蛋白约50μg，加1 mol/L DTT至终浓度10 mmol/L;蛋白溶液pH为8．0，56℃孵育60 min，冷却至室温。加入1 mol/L IAM至终浓度60 mmol/L，室温暗 处 孵 育 60 min。加 入 50 mmol/L NH4HCO3稀释尿素至终浓度不超过1 mol/L，按照胰蛋白酶与麦氏弧菌蛋白的量之比在1∶20 ～1∶100，加入1μg胰蛋白酶，37℃孵育过夜，再次加入同等剂量的胰蛋白酶，室温孵育24 h，得到麦氏弧菌总蛋白直接酶解液。

1．4 NanoL C-MS/MS分析 直接酶解液加入0．1%甲酸溶液，10 000 r/min，4℃离心后取上清液注入Nano LC-MS/MS仪器分析。

液相为Eksigent NanoLC-Ultra液相系统，色谱条件为:样品以300 nl/min上样到C18预柱上(Nano cHiPLC Trap column，200 μm ×0．5 mm ChromXPC18-CL 3 μm120 Å)，然后保持流速冲洗脱盐10 min。分析柱是cHiPLC反相柱(Nano cHiPLC column，75 μm × 15 cm ChromXP C18-CL 3 μm 120 Å)，上样量5μl，流动相A:2%乙腈(0．1% 甲酸)，B:98%乙腈(0．1%甲酸);流速300 nl/min，自动进样。梯度洗脱条件为:0 ～55 min，5% ～23%B;55～75 min，23% ～52%B;75～76 min，55% ～80%B;76 ～80 min，80%B;80 ～90 min，80% ～5%B，分析时间为90 min。

质谱检测条件:AB SCIEX TripleTOFTM5600+，ESI源，正离子扫描方式，离子源气体1:27．58 kPa，气帘:206．84 kPa，离子喷雾电压:2．3 kV。一级质谱扫描范围m/z350～1 250，250 ms，选择一级图谱最高的40个峰进行二级扫描。IDA(information dependent acquisition)扫描范围m/z100～1 500，电荷数为2～5的母离子被选择进行MS/MS分析。

1．5 麦氏弧菌蛋白鉴定 试验得到的质谱数据结果，在uniprot网站中麦氏弧菌(Vibrio metschnikovii CIP 69．14)蛋白质数据库中进行检索，数据库下载于网址“http://www．uniprot．org/uniprot/?query=Vibrio+metschnikovii＆sort=score”，包含3 089条蛋白信息。数据库检索软件为Protein-Pilot 4．5，参数的选择如下:样本类型:Identification;半胱氨酸烷基化:IAA;蛋白消化:Trypsin;仪器设备:TripleTOFTM5600+;特殊因子:None;种类:None;关注信息:Biological modifications Amino acid subsitution;数据库:Vibiro metschnikovii;搜索方式:Thorough;FDR统计分析:Yes。

2 结果与分析

2．1 提取蛋白的分析 麦氏弧菌提取蛋白使用bradford法对蛋白进行定量，定量标准曲线为:y=0．193x+0．004，R2=0．995，其中y为吸光度(595 nm)，x为BSA浓度，定量浓度为1．5 μg/μl。上清液 SDS-PAGE 电泳上样，上样量为10 μl，电泳结果见图1。

2．2 质谱分析及数据库检索 采用Nano LC-MS/MS对麦氏弧菌提取蛋白进行分析。上样量7．5μg，采集时间90 min，IDA扫描峰数为40时，一级图谱响应值约2．5×107，二级图谱为42 027张(图2)，色谱质谱图结果显示，在梯度时间内多肽组分分离良好，为质谱在单位时间内采集更多的数据提供了有利条件。

质谱分析的数据在uniprot网站中麦氏弧菌(Vibrio metschnikovii CIP 69．14)蛋白质数据库中进行检索，检索结果通过严格标准进行筛选(1%FDR，即所有鉴定到的蛋白质其可靠性在99%以上)，直接酶解鉴定到的蛋白数量为1 538个。鉴定的蛋白主要是参与代谢进程的酶类，如Glutamate dehydrogenase，Phosphoglycerate kinase;参与细胞生理过程的酶类，如 Adenosine deaminase，Na(+)-translocating NADH-quinone reductase;参与生物调节的酶类，如Lon protease，Zinc metalloprotease等。通过Gene Ontology分析(GO分析)，对鉴定到的蛋白通过BLAST提取基因进行分析，考察了麦氏弧菌分离菌株F5-1提取蛋白的分子功能、生物进程和细胞组分，具体分布见图3。

由图3A分子功能可见，具有催化活性的功能蛋白占较大比例，还有结合活性、结构分子活性、转录调节因子活性等功能蛋白。鉴定到的具有催化活性的蛋白质，如磷酸甘油酸激酶(Phosphoglycerate kinase)、葡萄糖-6-磷酸异构酶(Glucose-6-phosphate isomerase)、磷酸丙糖异构酶(Triosephosphate isomerase)、果糖二磷酸醛缩酶(Fructose-bisphosphate aldolase)等大部分是糖代谢相关蛋白，为麦氏弧菌细胞提供能量。

麦氏弧菌中具有结合活性蛋白，主要是核酸结合蛋白，如GTP结合蛋白(GTP-binding protein)、DNA结合蛋白(DNA-binding protein)、ABC转运蛋白的ATP结合蛋白(ABC transporter ATP-binding protein)等，与核酸结合的蛋白质负责细胞内DNA分子遗传信息的组织、复制和阅读。

该研究还鉴定到丝氨酸蛋白激酶(Serine protein kinase，SPK)，一类能使特定底物蛋白中丝氨酸羟基磷酸化的酶。SPK通过催化酶、受体、运输蛋白、调节蛋白、核内蛋白等多种功能蛋白的磷酸化，改变蛋白的构象，调节细胞多种生命活动过程［10－11］。作为蛋白激酶大家族中的一员，SPK过去曾被认为是真核生物所独有的，大量的相关研究也集中在真核生物中［12－13］，之后在黄色粘球菌、集胞藻、革兰氏阳性无乳链球菌等原核生物中陆续被发现［14－16］。研究发现，SPK可能参与结核分枝杆菌致病过程中的多个环节，并与致病性相关［17］，这提示麦氏弧菌的致病性可能有丝氨酸蛋白激酶的参与。

3 结论

研究细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式的学科即为蛋白质组学(proteomics)［18］，主要包括结构蛋白质组学和功能蛋白质组学。蛋白质组学的研究对象通常为具有高度复杂性的蛋白质或多肽的混合物，其技术可分为分离和鉴定2个方面。其中分离的技术手段以双向凝胶电泳和液相色谱为核心，而鉴定则主要依靠质谱技术。双向凝胶电泳结合质谱技术作为研究蛋白质组学最广泛技术手段，其局限性在于分离能力有限、存在歧视效应、操作程序复杂等缺陷，对于分析动态范围大、低丰度以及疏水性蛋白质的研究往往很难得到满意的结果。利用高效液相色谱技术分离蛋白质，并用高分辨质谱鉴定收集的组分，是最近发展起来的研究蛋白质组学有效技术手段［19－21］。

蛋白质组学研究要求有高分辨率的蛋白质分离及准确、灵敏的质谱鉴定技术。该研究采用纳升级反相液相色谱－串联质谱技术分析麦氏弧菌总蛋白的方法，具有高通量、高灵敏的特点，高分辨质谱系统分析了麦氏弧菌提取蛋白直接酶解肽段，数据库检索得到预测蛋白质氨基酸序列，通过与数据库中已知序列比对，鉴定到1 538种蛋白，蛋白鉴定数目约占物种Vibiro metschnikovii CIP 69．14总蛋白数的50%，进一步分析了部分提取蛋白质的生物学功能，为麦氏弧菌功能蛋白质组的深入研究奠定了基础。

［1］CAOJ，XUJ，ZHENGQ，et al．Rapid detection of Vibriometschnikovii in aquatic products by real-time PCR［J］．Folia microbiologica，2010，55(6):607－613．

［2］LINDE H J，KOBUCH R，JAYASINGHE S，et al．Vibrio metschnikovii，a rare cause of wound infection［J］．Journal of clinical microbiology，2004，42(10):4909－4911．

［3］李正义，贾俊涛，曹际娟，等．一株分离自美国龙虾的麦氏弧菌的鉴定及其低温状态下细胞脂肪酸的变化［J］．微生物学报，2013，53(6):628－634．

［4］WU RN，WANGWW，YUDL，et al．Proteomics analysis of Lactobacillus casei Zhang，a new probiotic bacterium isolated from traditional home-made koumiss in Inner Mongolia of China［J］．Molecular ＆ cellular proteomics，2009，8(10):2321 －2338．

［5］GUPTA A K，PATHAK R，SINGH B，et al．Proteomic analysis of global changes in protein expression during exposure of gamma radiation in Bacillus sp．HKG 112 isolated from saline soil［J］．Journal of microbiology and biotechnology，2011，21(6):574 －581．

［6］KHOT P D，FISHERA M A．Novel approach for differentiating Shigella species and Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption ionizationtime of flight mass spectrometry［J］．Journal of clinical microbiology，2013，51(11):3711－3716．

［7］ZHANGZ Q，LI X J，LIU GT，et al．Identification of Annexin A1 protein expression in human gastric adenocarcinoma using proteomics and tissue microarray［J］．World journal of gastroenterology，2013，19(43):7795 －7803．

［8］于海洋，晏嘉泽，郭明，等．纳升级反相液相色谱－串联质谱法分析锦灯笼提取物中的蛋白质［J］．色谱，2013，31(4):362 －366．

［9］陈霞，文红梅，刘睿，等．纳升级反相液相色谱－串联质谱法分析蜈蚣提取蛋白质［J］．分析化学，2013，42(2):239 －243．

［10］杨旭，关东明，王胜兰，等．链霉菌真核型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的研究进展［J］．微生物学报，2008，48(1):126 －131．

［11］陶晓迎，柴晓杰，薛飞，等．盐藻丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因DsSTPK的克隆、原核表达及纯化［J］．中国农学通报，2014，30(2):45 －49．

［12］PAN J，ZHANG M，KONG X，et al．a novel maize group D MAP kinase gene，is involved in multiple stress responses［J］．Planta，2012，235(4):661 －676．

［13］FRANZ S，EHLERT B，LIESE A，et al．Calcium-dependent protein kinase CPK21 functions in abiotic stress response［J］．Molecular plant，2011，4(1):83 －96．

［14］MUÑOZ-DORADO J，INOUYE S，INOUYE M．A gene encoding a protein serine/threonine kinase is required for normal development of M．xanthus，a gram-negative bacterium［J］．Cell，1991，67(5):995 －1006．

［15］HAN G，ZHANG C C．On the origin of Ser/Thr kinases in a prokaryote［J］．FEMSmicrobiology Letters，2001，200(1):79 －84．

［16］RAJAGOPAL L，VO A，SILVESTRONI A，et al．Regulation of purine biosynthesis by a eukaryotic-type kinase in Streptococcusagalactiae［J］．Molecular Microbiolog，2005，256(5):1329 －1346．

［17］康涵，吴文娟．丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶在结核分枝杆菌致病机制中的作用［J］．微生物与感染，2012，7(1):56 －61．

［18］乌日娜，孙志宏，张文羿，等．蛋白质组学在乳酸菌应激反应机制研究中的应用［J］．食品科学，2013，34(1):324 －327．

［19］SOARESE L，SHAH M，SOARESA A，et al．Proteome analysis of the inner integument from developing Jatropha curcas L．Seeds［J］．Journal of proteome research，2014，13(8):3562 －3570．

［20］李学鹏，陈杨，蔡路昀，等．蛋白质组学在水产品品质与安全研究中的应用［J］．食品科学，2015，36(9):209 －214．

［21］ROBERT M，ZATYLNY-GAUDIN C，FOURNIER V，et al．Transcriptomic and peptidomic analysis of protein hydrolysates fromthe whiteshrimp(L．vannamei)［J］．Journal of biotechnology，2014，186(9):30 －37．