根癌农杆菌介导VirE2-N-EGFP在2种茄科植物中的表达分析

杜利娟，薛 杨，张 旺，孙现超*　(.西南大学植物保护学院，重庆 40076；.中国农业科学院柑桔研究所，重庆 4007)



根癌农杆菌介导VirE2-N-EGFP在2种茄科植物中的表达分析

杜利娟1，薛 杨2，张 旺1，孙现超1*(1.西南大学植物保护学院，重庆 400716；2.中国农业科学院柑桔研究所，重庆 400712)

摘要为了明确根癌农杆菌介导的外源蛋白在茄科植物叶片细胞中能否瞬时表达，克隆了土壤根癌农杆菌的VirE2基因，并融合至绿色荧光蛋白(EGFP)的 N端，成功构建pPZP-VirE2-N-EGFP植物表达载体。以茄科的本氏烟为对照，根癌农杆菌介导在辣椒和番茄叶片细胞中进行了表达分析。用共同聚焦显微镜可以在本氏烟和辣椒叶片细胞中观察到绿色荧光，而在番茄叶片细胞中未观察到。表明外源蛋白VirE2-N-EGFP可以在辣椒叶片细胞瞬时表达。该研究结果为进一步研究辣椒中与植物病原互作基因的功能奠定了基础。

关键词根癌农杆菌；VirE2-N-EGFP；茄科植物；表达

Expression Analysis of VirE2-N-EGFP Mediated byAgrobacteriumin Two Solanaceae Plants

DU Li-juan1, XUE Yang2, ZHANG Wang1, SUN Xian-chao1*(1. College of Plant Protection, Southwest University, Chongqing 400716; 2. Citrus Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Chongqing 400712)

AbstractIn order to make it clear that whether heterologous protein could be transiently expressed in Solanaceae plants, we cloned the VirE2 gene from agrobacterium by PCR, fused it to the N terminal of EGFP and successfully constructed the plant expression vector pPZP-VirE2-N-EGFP. VirE2-N-EGFP was expressed in the leaf cells ofCapsicumannuumandLycopersiconesculentumMill mediated by agrobacterium, with the Nicotiana benthamiana as control. Green fluorescence was observed in the leaf cells ofNicotianabenthamianaandCapsicumannuum, but not in that ofLycopersiconesculentumMill. The results indicated that the heterologous protein VirE2-N-EGFP could be successfully expressed in the leaf cells ofCapsicumannuum, which provide a basis for research on the function of the pathogeny interacted protein inCapsicumannuum.

Key wordsAgrobacterium; VirE2-N-EGFPl; Solanaceae plants; Expression

在研究植物基因功能时，通常采用异源表达植物基因编码蛋白与荧光蛋白的融合蛋白方法，来分析该基因编码蛋白的功能或细胞定位。目前研究多是在烟草尤其是本氏烟或拟南芥中瞬时表达融合蛋白。而在有些情况下植物基因异源表达不能准确展示其真实功能，影响人对基因功能的正确理解。

随着功能基因组研究的逐渐深入，许多植物的基因组测序已经完成，对基因组中潜在功能基因的挖掘和利用是当前研究的热点。茄科植物很多与人们生活密切相关，对其基因组编码蛋白功能的准确诠译具有重要意义。VirE2是根癌土壤杆菌株C58Ti 质粒中vir 区的一个毒性蛋白[1]，其核靶向运输在农杆菌介导的植物遗传转化中起到非常关键的作用[2]。Dumas等[3]研究表明3VirE2 在磷脂双分子层内可以形成一个膜通道，该通道是单链DNA 的特异性通道，有助于单链DNA 有效的跨膜运输，保证外源DNA 能顺利进入到植物细胞质中。为了更好地在茄科作物中瞬时表达其自身编码蛋白，笔者克隆了土壤根癌农杆菌的VirE2，分析了其在茄科烟草、辣椒和番茄3种作物叶片中的瞬时表达情况。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株和质粒。供试大肠杆菌DH5α由西南大学植物保护学院保存。根癌土壤杆菌株C58、植物表达载体pPZP-RCS1和中间载体pSAT1-N-EGFP由美国纽约州立大学石溪分校Vitaly教授赠送。本氏烟、番茄和辣椒种子由西南大学植物保护学院保存，在温室育苗盆中播种，培养至4~6叶期备用。

1.1.2试剂和引物。高保真ExTaqTMDNA聚合酶、T4 DNA连接酶购自大连宝生物工程公司，限制性内切酶购自NEB公司。

根据U.Washington 发表的根癌土壤农杆菌C58基因全序列，自行设计一对引物，由华大基因公司合成，其正向引物基因序列VirE2 F：5′-GAGAATTCATGGATCCGAAGGCCGA-3′；反向引物VirE2 R：5′-CAGCCCGGGGTGACGCGGTATCAGGAA-3′。

1.2方法

1.2.1土壤根癌农杆菌C58质粒的提取。参照农杆菌Ti 质粒碱法小量提取方法[4]，提取并纯化C58质粒，用TE溶解，-20 ℃保存备用。

1.2.2VirE2 基因克隆。以获得的质粒为模板，VirE2 F和VirE2 R为引物进行PCR扩增。反应体系(50 μl)：10 × PCR buffer 5 μl，dNTP(2.5 mmol)2 μl，MgCl2(2.5 mmol)4 μl，引物(3 μmol)各2 μl，模板1 μl(约5 ng)，去离子水34 μl。反应条件：95 ℃ 预变性4 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。

1.2.3VirE2-N-EGFP融合蛋白植物表达载体的构建。根据刘红玲等[4]构建的融合蛋白植物表达载体构建系统，将克隆基因用EcoR I和SmaI进行酶切，连接到相应酶切过的pSAT1-N-EGFP中间载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有100 mg/L Ampicilin的LB平板培养，挑取菌落，并提取重组质粒进行PCR鉴定，选取3个克隆送华大基因公司测序验证。在成功构建的重组质粒上，用AscI酶切下表达盒，连接到经同样酶切过并去磷酸化的pPZP-RCS1载体上，在含有500 mg/L 壮观霉素的LB平板培养，PCR鉴定筛选阳性克隆，并再次酶切鉴定。

1.2.4根癌土壤杆菌EHA105菌株感受态细胞的制备及质粒转化。从-80 ℃冰箱取出保存的EHA105菌株，划平板过夜，挑选单菌落接种于无抗生素的YEP液体培养基中摇菌12~16 h，CaCl2法制备感受态细胞。参考Liu等[5]方法将pPZP-VirE2-N-EGFP以热击法转化到根癌土壤杆菌EHA105感受态细胞中。取2份100 μl EHA105感受态细胞分别加入5 μl pPZP-VirE2-N-EGFP、空载体的质粒pPZP-RCS1(对照)，冰浴30 min，然后液氮速冻5 min，37 ℃水浴锅浸浴5 min，迅速冰浴2 min，加入1 ml无抗YEP液体培养基，28 ℃轻摇4~6 h。离心弃400 μl上清，其余均匀涂布于含有壮观霉素的YEP固体培养基上，28 ℃培养至少2 d，观察菌落生长情况。菌落PCR扩增鉴定。将扩增出目的基因片段的菌落扩大培养，与25%甘油按1∶1置-80 ℃保存。

1.2.5pzp-EGFP-N-VirE2在本氏烟、辣椒和番茄的瞬时表达和检测。参考Li等[6]方法，采用根癌土壤杆菌渗入法将含pzp-EGFP-N-VirE2的根癌土壤杆菌EHA105分别注射到四叶期本氏烟和茄科作物辣椒、番茄叶片中，置于培养箱中培养(白天27 ℃光照16 h，晚上22 ℃黑暗8 h)，3 d后分别取不同处理注射口附近的叶片部分，制作玻片，用共聚焦荧光显微镜检测本氏烟和辣椒、番茄叶片中pzp-EGFP-N-VirE2是否能瞬时表达。以健康的本氏烟和辣椒、番茄叶片为空白对照，以注射带有空载体的根癌土壤杆菌的叶片为阴性对照。每个处理重复3次。

2结果与分析

2.1根癌土壤农杆菌Ti质粒毒性区蛋白VirE2基因的克隆以VirE2 F和VirE2 R为引物从土壤根癌农杆菌C58 Ti质粒中PCR扩增的目的片段，经1%葡聚糖凝胶电泳检测显示条带约为1 700 bp，与预期VirE2基因1690大小基本一致(图1)。

2.2VirE2-N-EGFP融合蛋白植物表达载体的构建将VirE2用PCR产物回收试剂盒割胶回收后，用EcoR I和SmaI酶切，再次割胶回收，连接到同样酶切过的pSAT1-N-EGFP载体中，经PCR鉴定筛选获得阳性克隆pSAT1-VirE2-N-EGF。测序验证表明VirE2基因大小1 668 bp，与目的基因100%同源，起始位置含有起始密码在ATG，而末端不含终止密码子。在EGFP N端与EGFP融合成一个基因VirE2-N-EGFP。在pSAT1-VirE2-N-EGF载体中VirE2-N-EGFP与上游含的2个35S启动子和末端的Nos终止子构成一个4 000 bp左右的表达盒。表达盒两端均有一个AscI酶切位点。用Asc I将表达盒切下，连接到植物表达载体pPZP-RCS1上，经酶切鉴定表明，成功获得VirE2-N-EGFP融合蛋白植物表达载体pPZP- VirE2 -N- EGFP(图2)。

2.3pzp-EGFP-N-VirE2在本氏烟、辣椒和番茄中的瞬时表达和检测将pPZP-VirE2-N-EGFP转化至根癌土壤杆菌EHA105，用同样的方法注射本氏烟、辣椒和番茄叶片中，注射3 d后用共聚焦荧光显微镜观察，结果显示，pzp-EGFP-N-VirE2在根癌土壤杆菌的介导下在本氏烟和辣椒叶片中检测到GFP，但在番茄叶片中没有。表明用根癌土壤杆菌渗入法可以使VirE2-N-EGFP融合蛋白成功在本氏烟、辣椒中表达(图2)，而在番茄叶片中未表达。

3讨论

在本氏烟叶片中瞬时表达外源基因已经是一项非常成熟的技术[7-10]，该研究中VirE2-GFP在本氏烟中也明显表达，表明该试验过程是成功的。虽然农杆菌介导的辣椒遗传转化获得转基因辣椒多有报道[11-12]，而在辣椒叶片中瞬时表达外源基因在国内尚未见报道。利用转基因来研究基因功能固然是有效的基因功能研究手段，但转基因植物获得需要时间明显多于瞬时表达，因此在功能基因组时代大量鉴定基因功能仍需要瞬时表达技术。该研究成功在辣椒中表达外源基因融合蛋白VirE2-GFP，对利用瞬时表达研究辣椒功能基因具有一定的参考价值。

农杆菌介导的番茄遗传转化体系已成为成熟的技术体系[13-14]。Orzaez等[15]研究表明，从番茄花柱顶端注射农杆菌渗入整个果实后，在果实中可检测到瞬时表达的目的基因。牛颜冰等[16]利用马铃薯X病毒载体在番茄果实中成功表达了达胸腺素α1。张月丽等[17]利用根癌农杆菌注射方法成功地在番茄源叶和番茄果实中瞬时表达了转化酶抑制子(inhibitors of invertases，INH)，并明确INH 主要在翻译后水平调控转化酶的活性。该试验未能在番茄叶片中检测到VirE2-GFP融合蛋白的表达，其原因尚不明确。张大燕等[18]利用根癌农杆菌介导微小RNA在miRn51时发现桑树的不同品种对外源基因的瞬时表达效率有一定影响。该试验也可能存在番茄品种差异导致根癌农杆菌介导外源基因表达差异的原因。因此，需要用不同的番茄品种来进一步分析明确。

参考文献

[1] LOYTER A，ROSENBLUH J，ZAKAI N，et al.The plant VirE2 interacting protein 1.A molecular link between theAgrobacteriumT-complex and the host cell chromatin[J].Plant physiology，2005，138(3)：1318-1321.

[2] GELVIN S B.Finding a way to the nucleus[J].Current opinion in microbiology，2010，13(1)：53-58.

[3] DUMAS F，DUCKELY M，PELCZAR P，et al.AnAgrobacteriumVirE2 channel for transferred-DNA transport into plant cells[J].Proceedings of the national academy of sciences，2001，98(2)：485-490.

[4] 刘红玲，李小红，王彦芹，等.根癌土壤农杆菌 Ti 质粒 VirE2 基因的克隆及原核表达[J].生物技术，2010，20(3)：13-16.

[5] LIU Z M，LIU Z Z，BAI Q W，et al.Agroinfiltration，a useful technique in plant molecular biology research[J].Chinese journal of biotechnology，2002，18(4)：411-414.

[6] LI Y，GENG Y，SONG H，et al.Expression of a human lactoferrin N-lobe in Nicotiana benthmiana with potato virus X-based agroinfection[J].Biotechnology letters，2004，26(12)：953-957.

[7] KOPERTEKH L，SCHIEMANN J.Agroinfiltration as a tool for transient expression of cre recombinase in vivo[J].Transgenic research，2005，14(5)：793-798.

[8] FISCHER R，VAQUERO-MARTIN C，SACK M，et al.Towards molecular farming in the future：Transient protein expression in plants[J].Biotechnology and applied biochemistry，1999，30(2)：113-116.

[9] VAN DER HOORN R A L，LAURENT F，ROTH R，et al.Agroinfiltration is a versatile tool that facilitates comparative analyses of Avr 9/Cf-9-induced and Avr 4/Cf-4-induced necrosis[J].Molecular plant-microbe interactions，2000，13(4)：439-446.

[10] PALANICHELVAM K，COLE A B，SHABABI M，et al.Agroinfiltration of Cauliflower mosaic virus gene VI elicits hypersensitive response in Nicotiana species[J].Molecular plant-microbe interactions，2000，13(11)：1275-1279.

[11] 王朋，王关林，方宏筠.抗虫基因(CpTI)辣椒转化的初步研究[J].沈阳农业大学学报，2002，33(1)：30-32.

[12] 毕玉平，单蕾，王兴军，等.双抗 TMV+ CMV 辣椒转基因工程植株的再生及抗病毒鉴定[J].华北农学报，1999，14(3)：103-108.

[13] 赵楠，林璟瑜，王淑芳，等.过表达 B 基因的转基因微型番茄的获得[J].南开大学学报：自然科学版，2006，39(4)：103-107.

[14] 许涛，梅伟利，李天来，等.番茄 ARF2 启动子的克隆及其转基因植株鉴定[J].沈阳农业大学学报，2014，45(2)：129-133.

[15] ORZAEZ D，MIRABEL S，WIELAND W H，et al.Agroinjection of tomato fruits.A tool for rapid functional analysis of transgenes directly in fruit[J].Plant physiology，2006，140(1)：3-11.

[16] 牛颜冰，史正文，王德富，等.重组马铃薯 X 病毒注射番茄果实高效表达胸腺素 α1[J].生物工程学报，2009，25(4)：537-541.

[17] 张月丽，杨艳丽，姜晶.农杆菌介导的 INH 基因瞬时表达系统的建立及表达分析[J].分子植物育种，2012(11)：217-224.

[18] 张大燕，贾凌，向仲怀，等.农杆菌介导的桑树瞬时表达体系构建及 miRn51 与其靶基因的表达分析[J].蚕业科学，2015，4(1)：10-17.

收稿日期2015-10-26

作者简介杜利娟(1989- )，女，河南焦作人，硕士研究生，研究方向：植物病害与病原互作。*通讯作者，研究员，硕士生导师，从事植物病毒与病害生物防治研究。

基金项目国家自然科学基金项目(30900937)；中央高校基本科研业务费专项资金项目(XDJK2016A009，2362015xk04)；中国烟草总公司四川省公司科技项目(201202007)；中国烟草总公司湖南省公司科技项目(14-16ZDAa02)。

中图分类号S 188

文献标识码A

文章编号0517-6611(2015)33-254-03