乐清湾滩涂养殖贝类微生物富集及海水净化研究

金 雷，陈雪昌，陈 瑜，刘 欢，郭远明

(1．浙江省海洋水产研究所，农业部重点渔场渔业资源科学观测实验站，浙江省海洋渔业资源可持续利用技术研究重点实验室，浙江舟山316100;

2．中国水产科学研究院，北京100000)

乐清湾位于浙江省中南部沿海，因为滩涂面积十分广阔，加上近岸海水浑浊度大、泥质滩涂、有机质丰富等特点，是浙江省海水滩涂贝类养殖的主要产区［1-2］。其中，主要以养殖缢蛏(Sinonovacula constricta)、文蛤(Meretrix meretrix)、泥蚶(Tegillarca granosa)等滤食性双壳贝类为主，其养殖面积和产量均占海水滩涂贝类养殖总面积和产量的80%以上。但是，近年来随着乐清湾地区人口密集化程度的不断提高，生活污水排放日益增多，使得部分养殖海域受到不同程度污染［3-5］。

贝类不仅营养丰富、滋味鲜美、价格低廉，而且富含牛磺酸，具有养生保健功能，因此深受消费者的青睐。然而，双壳贝类属于滤食性生物，在滤食饵料生物的同时，会将水体中的微生物吸入体内，食用病原微生物寄生的贝类极易引发疾病，从而暴发贝类中毒事件。为了保障消费者食用贝类产品卫生和安全，农业部渔业局和浙江省海洋与渔业局从2008年起就对乐清湾主要贝类养殖海区的环境状况以及养殖贝类卫生状况进行了分类管理工作。笔者通过对乐清湾不同品种滩涂养殖贝类的微生物进行抽样检测，掌握不同品种贝类对微生物富集能力的差异。同时，对贝类生长环境中的水体进行微生物检测，确定生长水体对贝类富集微生物的影响程度。最后，通过水体净化试验，确定贝类微生物含量的增减规律。

1 材料与方法

1．1 采样站位的设置 选择乐清湾沿岸主要的海水滩涂贝类养殖区作为监测位点，共设置15个监测位点，其中温岭市5个，玉环县5个，乐清市5个，具体监测位点如图1所示。

1．2 主要仪器 隔水式恒温培养箱(型号GHP-9270);智能光照培养箱(型号GXZ);生物安全柜(型号BSC-1000ⅡA2);立式压力蒸汽灭菌器(型号YXQ-LS-50G);其他实验室常用设备。

1．3 培养基及试剂 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤、EC肉汤(E．coli broth)、伊红美蓝(EMB)琼脂、营养琼脂、乳糖蛋白胨培养基、平板计数琼脂、2216E琼脂和HBI生化鉴定试剂盒等，均购自青岛海博生物技术有限公司;其余均为实验室常用试剂。

暂养的海水购自舟山市普陀区东河市场。海水理化特性如下:水温24 ℃，pH 7．5，盐度31．0 ‰，溶解氧6．75 mg/L，无色透明;细菌总数 ＜10 CFU/ml，粪大肠菌群＜20 MPN/L。

1．4 检测方法

1．4．1 贝类大肠杆菌和菌落总数的检测。大肠杆菌按照GB4789．38-2012食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数。将贝类撬壳称取25 g肉，放入盛有225 ml磷酸盐缓冲液中均质，制作成1∶10的样品匀液。选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液)，每个稀释度接种3管，然后放入培养箱中培养。经过初发酵、复发酵和生理生化试验，计数阳性管数，查MPN表。

菌落总数按照GB4789．2-2010食品微生物学检验菌落总数测定。将贝类撬壳称取25 g肉，放入盛有225 ml磷酸盐缓冲液中均质，制作成1∶10的样品匀液。然后，选择合适的3个稀释度，每个稀释度做二个平板，用灭菌冷却至46℃的平板计数琼脂培养基倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。待琼脂凝固后，将平板翻转，(30±1)℃培养(72±3)h。

所有试验数据均为3次重复的平均值，试验数据使用Excel软件进行统计与分析。

1．4．2 海水中粪大肠菌群和细菌总数的检测。参照GB17378．7-2007海洋监测规范第7部分近海污染生态调查和生物监测。粪大肠菌群采用发酵法测定，细菌总数采用平板计数法测定。所有试验数据均为3次重复的平均值，试验数据使用Excel软件进行统计与分析。

1．5 净化试验方法［6］以缢蛏为研究贝类，采集乐清湾受污染较为严重的缢蛏，当天立即对缢蛏中大肠杆菌和菌落总数进行检测，同时对缢蛏样品进行暂养和净化，暂养海水持续充氧，每隔24 h换水1次。此后每天换水前抽样检测缢蛏样品中大肠杆菌和菌落总数，连续抽样检测5 d。

2 结果与分析

2．1 不同品种贝类对微生物富集能力研究 对乐清湾15个监测位点进行了3个批次的采样检测，样品总数为45个。其中，缢蛏25个、文蛤10个、泥蚶10个。由表1可知，缢蛏中大肠杆菌的含量范围为4 600～110 000 MPN/kg，菌落总数的含量范围为1．2×104～3．9 ×105CFU/g，在抽检的3个贝类品种中其数值范围和上限最高。依据《农业关于印发2015年度海水贝类产品卫生监测和生产区域划型工作方案的通知》(农渔发［2015］16号)文件，大肠杆菌数值为110 000 MPN/kg的贝类属于第三类生产区(大于46 000 MPN/kg，且小于等于460 000 MPN/kg)，该区域生产的贝类产品须进行暂养或净化，需达到二类生产区域(大于2 300 MPN/kg，且小于等于46 000 MPN/kg)贝类安全标准后方可上市。文蛤与泥蚶的大肠杆菌和菌落总数的含量范围相近，二者没有显著差异。这2种贝类的大肠杆菌数值符合二类生产区域的要求，可上市但不可生食。

表1 不同品种贝类的微生物含量

2．2 贝类生长水体的微生物测定 为了研究贝类生长环境水质对其富集微生物的影响，分别选取温岭、玉环和乐清各1个贝类养殖位点，对该位点的海水中粪大肠菌群和细菌总数进行测定，并抽取5个相应位点的贝类样品进行大肠杆菌和菌落总数检测。由表2可知，海水中的粪大肠菌群和细菌总数含量越高，则该环境下生长的贝类中大肠杆菌和菌落总数就越高。因此，二者呈一定的正相关。海水是贝类生长的直接外界环境，海水中的微生物会直接影响贝类的细菌含量。

表2 贝类生长水体的微生物含量

表3 净化试验中大肠杆菌和菌落总数的检测结果

2．3 净化试验 以缢蛏为研究贝类，样品采集当天缢蛏中大肠杆菌的检出值＞110 000 MPN/kg，菌落总数为3．1×105CFU/g，该贝类生产区属于第三类生产区，该区域生产的贝类须进行暂养或净化。净化试验每隔24 h换水1次，每天换水前进行抽样检测，连续抽样5 d。由表3可知，净化第1天缢蛏中大肠杆菌的检测结果为46 000 MPN/kg，已符合二类生产区标准，可上市但不可生食。随着暂养净化时间的增加，缢蛏中大肠杆菌的数值也随之减少，第3天大肠杆菌的检测数值为2 300 MPN/kg，符合一类生产区标准，该区域生产的贝类产品可直接上市。第4、5天大肠杆菌的检测数值小于300 MPN/kg，表明大肠杆菌已经很难被检出。同时，菌落总数的检出值也随着暂养净化时间的增加而减少，第5天菌落总数的检出值为1．8×102CFU/g。

3 小结

笔者研究了不同品种贝类对微生物富集能力的差异，贝类生长环境水质对其富集微生物的影响和微生物污染贝类的海水净化试验。结果表明，在研究的缢蛏、文蛤、泥蚶样品中缢蛏富集大肠杆菌和菌落总数的数值相对较高，文蛤和泥蚶富集能力没有显著性差异;海水中的粪大肠菌群和细菌总数含量越高，则该环境下生长的贝类中大肠杆菌和菌落总数就越高，二者呈一定的正相关;污染的缢蛏随着暂养净化时间的增加，缢蛏中大肠杆菌和菌落总数的数值也随之减少。

［1］林志华，尤仲杰．浙江滩涂贝类养殖高产技术模式［J］．海洋科学，2005，29(8):95-99．

［2］朱秋华，钱国英．浙江省贝类养殖业可持续发展策略初探［J］．浙江万里学院学报，2000，13(2):16-17．

［3］柴雪良，张炯明，方军，等．乐清湾、三门湾主要滤食性养殖贝类碳收支的研究［J］．上海水产大学学报，2006，15(1):52-58．

［4］宋凯，郭远明，梅光明，等．浙南主要养殖海域环境和贝类两种重金属含量调查研究［J］．水产科技情报，2014，41(3):120-123．

［5］陈雪昌，梅光明，郭远明，等．浙江沿岸养殖贝类有毒有害物质污染状况监测研究［J］．浙江海洋学院学报(自然科学版)，2011，30(1):40-45．

［6］鲍静姣，郭远明，金雷，等．受污染缢蛏大肠埃希氏菌的净化研究［J］．广州化工，2014，42(16):65-66．