海洋生物中肝素类物质的提取纯化技术研究进展

陈 思，张小军，龙 举，严忠雍，李佩佩，方 益　(浙江省海洋水产研究所，浙江省海水增养殖重点实验室，浙江舟山 316100)



海洋生物中肝素类物质的提取纯化技术研究进展

陈 思，张小军*，龙 举，严忠雍，李佩佩，方 益(浙江省海洋水产研究所，浙江省海水增养殖重点实验室，浙江舟山 316100)

肝素是一种酸性黏多糖(糖胺聚糖)，自首次作为凝血剂应用于临床至今已有60多年，但由于较大的出血副作用而限制了其临床应用。由于近年来疯牛病在欧美地区流行，造成了牛肺肝素的应用受到限制[1]。受全世界生猪出栏数量的限制，猪小肠来源紧张也成为肝素钠生产链的一大障碍。近年来，发生的肝素污染事件也迫使人们寻找新的肝素类候选药物。

陆源动、植物一直是新药筛选的首选原料，对海洋生物中活性物质的开发和利用在近年来才逐渐得到发展。海洋独特的环境造就了众多具有特异功能的活性物质，从海洋生物中筛选出的新结构化合物普遍具有显著的药理作用[2]。以这些非哺乳动物为来源制备治疗性药物，可以减少病原体污染的危险性，因此来自海洋的天然酸性多糖可作为肝素类候选药物的重要来源。

目前肝素的高效提取纯化工艺技术的研究，对于改善我国肝素的产业结构和提高产品的市场竞争力具有重要意义。笔者对近年来国内外海洋生物中肝素提取纯化的工艺技术进行了综述，旨在为今后开发利用海洋生物肝素提供参考和帮助。

1肝素和低分子肝素

肝素的主要组成部分是三硫酸双糖单位，即肝素是由糖醛酸(L-艾杜糖醛酸IdoA和D-葡萄糖醛酸GlcA)和己糖胺(ɑ-D-葡糖胺，GlcN)以及它们的衍生物(乙酰化、硫酸化)形成的双糖单位连接而成的不均一多糖[3]。海洋生物中提取的低分子肝素(Low molecular weight heparin，LMWH)与肝素结构一样，呈一种不均一状态，糖链中糖单位上硫酸化的数目和位置不均一，糖链的长短不均一。肝素的分子量为3 000~40 000 D，LMWH是分子量为5 000 D(3 000~8 000 D)的小分子。肝素与LMWH抗凝活性的作用机制主要通过活化抗凝血酶Ⅲ(Antithrombin Ⅲ，AT Ⅲ)而发挥作用的，肝素链中存在的独特五糖序列能诱导AT Ⅲ构象改变，从而激活AT Ⅲ[4]。

虽然肝素迄今仍然是使用最为广泛的有效凝剂之一，但其在临床应用中也暴露出很多缺点，如停药后血栓易复发、自发性出血倾向、剂量个体差异大等[5]，这些因素都限制了肝素的使用。近年来，LMWH有逐步取代肝素的趋势，LMWH具有选择性强、抗血栓作用显著增强、临床疗效确切、使用安全、对血小板副作用小等优点[6]，从海洋生物中分离提取低分子量肝素是目前的主要研究方向。

2肝素的提取

肝素的提取主要以动物内脏为原料，常用的有猪小肠和牛肺。肝素主要以糖-蛋白质复合物的形式分布于动物组织的肥大细胞中。因此，在肝素的提取中应首先打断肝素与蛋白的结合，再通过盐析或酶水解等方法去除蛋白质，从而得到粗品肝素[7]。

2.1盐析提取法盐析提取法是海洋生物中最为常用的肝素提取方法，该方法利用的是蛋白质在高浓度的盐溶液中溶解度降低而沉淀的特性。其主要操作工艺是在碱性环境下用盐将肝素从肝素-蛋白复合物中分离出来，经吸附、洗脱、乙醇沉淀、干燥一系列的处理后得到肝素粗品。该方法的优点是操作简单和成本低廉，而缺点是蛋白质不能完全除去[7]。Saravanan等[1]以硫酸钠为盐析剂热水浸提，以硫酸铝为凝结剂除去蛋白质，并通过季铵盐(西吡氯胺，CPC)络合沉淀，从海洋双壳类软体动物Amussiumpleuronectus中提取出了1种LMWH粗品。Balamurugan等[8]利用相似的方法在乐谱芋螺中提取出了类肝素物质，并进行了结构鉴定。Arumugam等[9]也从长砗磲和翡翠贻贝的体液组织中分离到肝素。

2.2酶解提取法肝素多糖以共价键的形式与蛋白结合形成复合物存在于动物组织中，蛋白酶可将肝素和蛋白质的结合部位切断，使肝素从肝素蛋白质复合物中解离出来，同时将杂蛋白降解为小分子肽。通过调节pH、热变性和盐析法可除去蛋白酶和被降解的蛋白质制得肝素。目前，海洋生物中肝素提取常用的蛋白酶有胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和链霉菌蛋白酶等[7]。该方法条件温和，简化了后续的脱蛋白工艺，肝素粗品的得率较高，但试验稳定性要求高。Gandra等[10]利用木瓜酶解提取法比较了类肝素物质在皱瘤海鞘各组织(肠、心脏、咽和外套膜)中的分布情况，结果表明类肝素聚合物在海鞘肠中含量最高，在海鞘心脏和外套膜中含量居中，而在海鞘咽中含量最低。Brito等[11]和Dreyfuss等[12]研究表明采用superase酶解虾头下脚料，并经离子交换树脂吸附、洗脱和醇沉处理后得到的肝素类似物具有显著的抗炎和抗血管生成活性，可用作老年性黄斑病变的潜在药物。Ticar等[13]报道了从方斑狮子鱼卵中制备肝素的工艺条件，其最佳工艺条件为：Protamex酶解温度47.40 ℃，酶水解时间26.50 h，pH6.60，料液比1.34%(w/w)，条件优化后肝素产率可达2.10%(w/w)，可以有效提取鱼卵中的肝素类物质。

2.3超声波提取法超声波提取法是利用超声波的机械振动、空化作用和热效应等对细胞组织的破碎作用，提高糖类物质在提取液中的溶解度和浸出率，从而达到快速提取的目的[14]。作为海洋生物中肝素类物质的新型提取方法，超声波提取有不需加热、提取率高、对生物活性的影响小、溶剂用量少等特点。Fidelis等[15]研究表明比较超声波结合水提法和单独水提法，可食性海藻中硫酸化多糖的总产量并无明显差异；若辅以酶解处理，超声波水提下目标物的总产量显著提高；在碱性环境中，超声波结合酶解法的多糖产量最高，达到413 mg/kg。Achour等[16]报道采用超声波辅助过氧化氢降解法制成的LMWH的抗凝血能力与商用低分子肝素一样，且抗Xa与抗Ⅱa活性更高。

3肝素的分离与纯化

粗品肝素中往往含有其他黏多糖，也含有大量未除尽的蛋白质和核酸类物质，严重影响肝素的最终品质。需要利用不同黏多糖电荷密度或溶解度的差异进行分离，从而得到单一种类的黏多糖。目前，海洋生物中肝素类物质分离与纯化的主要方法包括有机溶剂分级沉淀法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法和亲和层析法。

3.1有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法是纯化生物大分子物质的一种最简便常见的方法，可用于黏多糖的分离。该方法利用不同黏多糖在不同溶剂中的溶解度不同而使黏多糖得到分离，虽然原理简单，但往往存在交叉沉淀，常常需要通过分步沉淀对比沉淀产物，以得到纯度较高的产品。Jeske等[17]研究发现在石斑鱼皮、鲶鱼皮、鳟鱼皮、鳕鱼皮和金枪鱼皮等多种海洋资源中，由金枪鱼皮制备的黏多糖粗品抗凝活性最高。利用丙酮对金枪鱼皮中提取的肝素粗品进行连续沉淀，结果表明当加入的丙酮体积为溶液体积的0.55倍~0.65倍时，可以得到纯度大于90%的肝素。Medeiros等[18]选取13门23种海洋生物作为原料，将醇沉复溶的样液用0.5倍体积的丙酮沉淀时可以得到类肝素物质，结果表明，肝素类物质普遍存在于海洋生物中，由海胆和蟹制备的类肝素纯品抗凝活性分别为60和52 IU/mg。Gomes等[19]采用70%的乙醇沉淀法，从双壳类软体动物中制备硫酸乙酰肝素物质，其产量可达0.5~0.6 mg/g干组织。

3.2离子交换层析离子交换层析的原理是同类型的带电离子间可自由地相互交换和竞争结合，近年来其用于海洋生物中肝素分离越来越普遍。肝素在低浓度盐溶液中以聚阴离子的形式存在，与阴离子交换剂上的阴离子竞争，发生离子交换后被吸附到交换剂上，然后可通过高盐浓度溶液梯度洗脱完成对肝素的纯化。该方法纯化率和回收率高，在生产上有利于放大，成本较凝胶过滤和亲和层析低。常用于纯化肝素及其类似物的离子交换剂有Amberlite IRA 120/900、DEAE-Cellulose、Sephadex A-25，凝胶过滤剂有Sephadex-G 25/100/150[1，11，20-21]。Shobharani等[22]利用DEAE-Cellulose阴离子交换柱对马尾藻发酵物的醇沉多糖进行了分离与纯化，结果表明洗脱所得第2馏分的效价为(6.70±0.22)IU/mg，其抗凝活性是粗多糖的2.6~3.9倍，可用作商业肝素的替代品。Saravanan等[1]报道了从双壳软体动物中利用DEAE-Cellulose、Amberlite离子交换柱结合Sephadex G-100凝胶过滤柱纯化低分子肝素的方法，纯化到的低分子肝素效价分别为72、84和95 IU/mg。Brito等[23]利用离子交换树脂吸附，盐溶液洗脱，所得黏多糖用丙酮分级沉淀，最后由DEAE-Sephacel离子交换柱纯化，从虾头酶解物中提取出一种肝素/硫酸乙酰肝素混合物，具有抗凝血能力强和无出血副作用等特点。

3.3亲和层析亲和层析法分离是将具有特异性亲和力的分子制成固相吸附剂置于层析柱中，当提取液通过层析柱时，与此吸附剂具有亲和力的组分就会被吸附在层析柱上，从而实现肝素物质的分离与纯化。Schmer等[24]研发了鱼精蛋白偶联琼脂糖作为亲和吸附剂，以1.3~2.0 mol/L氯化钠-咪唑缓冲液分步洗脱、纯化高活性肝素的方法，分离到肝素的最高效价可达270～305 U/mg。Höök等[25]报道了利用溴化氰活化琼脂糖并采用抗凝血酶通过氨基与之偶联制备成固相吸附剂，用于分离高活性和低活性的肝素组分。Chavante等[26]从虾头中分离出一种具有显著抗炎作用的肝素类黏多糖，利用亲和层析原理对该肝素类物质进行了分离纯化及结构鉴定。

4小结

海洋生物中肝素类物质是结构最复杂的糖胺聚糖，其单糖组成和连接方式各异，如何解释不同肝素间的特异性结构与其对应生物活性的关系一直是各国研究者的技术难题。目前，海洋生物中肝素的酶法提取，特别是对肝素的酶降解已成为研究热点。在海洋生物中肝素的分离纯化方面，离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等已经得到广泛应用。随着科学技术的不断发展，各种新型分析方法和技术将有助于彻底了解肝素的生物活性和精确结构，加速肝素类物质的分离、纯化及产业化研究，实现海洋生物资源中肝素类物质的深入开发与利用。

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摘要肝素是一类结构异常复杂的糖胺聚糖混合物，因其具有多种生物学功能，其提取纯化方法一直是各国学者研究的热点。综述了肝素的结构特点、生物功能及提取纯化技术进行了综述，重点阐述了肝素及其类似物分离纯化技术在海洋生物资源利用方面的最新研究进展及趋势。

关键词肝素；海洋；提取；分离；纯化

Research Progress in Extraction and Purification Technology of Heparin from Marine Sources

CHEN Si, ZHANG Xiao-jun*, LONG Ju et al(Key Laboratory of Marine Aquaculture, Zhejiang Institute of Marine Fisheries, Zhoushan, Zhejiang 316100)

AbstractHeparin is a class of glycosaminoglycans with very complex structures. Because of a variety of biological functions, its extraction and purification methods have been focused research area for the scholars all over the world. The structural characteristics and biological properties of heparin were summarized, extraction and purification technology of heparin were reviewed, focusing on research progress and trend of separation and purification for heparin and its heparin-like compounds in marine resources.

Key wordsHeparin; Marine; Extraction; Separation; Purification

收稿日期2015-10-14

作者简介陈思(1984-)，女，浙江杭州人，工程师，博士，从事水产品加工及质量安全方面研究。*

通讯作者，工程师，博士，从事水产品加工及质量安全方面的研究。

基金项目浙江省公益技术研究项目(2014C32087)。

中图分类号S 986.2

文献标识码A

文章编号0517-6611(2015)32-082-03