NLRP3/ASC/caspase-1/IL-1β/IL-18轴在大鼠脓毒症急性肾损伤中的作用

穆晓琨，毕 琳

(1．肇庆学院生命科学学院，广东肇庆526061;2．四川省犍为县动物疫病预防控制中心，四川乐山614400)

急性肾损伤(Acute kidney injury，AKI)原名急性肾衰竭，是一种涉及多学科的临床常见危重病症，该疾病突发性高，病程进展快，死亡率高，且发病率逐年上升［1］。AKI可由感染、烧伤、肾动脉狭窄等各种原因引起。研究表明，药物是导致AKI的首位病因，滥用药物是急性肾损伤的一大诱因，在所有的急性肾脏损伤患者中脓毒症是临床诱发AKI的最重要原因之一［2－3］。脓毒症是病原微生物侵入机体所致的全身炎症反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，临床上证实有细菌存在或有高度可疑感染灶，可引起多器官功能障碍综合征(Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，本质上而言脓毒症是机体对感染性因素的反应。一旦脓毒症合并AKI，死亡率将高达70%［4］。因此，脓毒症致AKI是危重急救医学和肾脏病学着重解决的难题。

Nod样受体蛋白3(NLRP3)是一种存在于细胞胞浆中的多蛋白复合物，主要是由NLRP3、ASC和Caspase-1相互结合形成，是天然免疫系统的重要组成部分［5－7］。核心蛋白NLRP3被激活后，通过衔接蛋白ASC以及无活性的半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶1(caspase-1)，形成 NLRP3炎症复合体，进而活化caspase-1，切割IL-18和IL-1β的前体，使其成

熟并释放。研究表明，NLRP3炎症小体与多种代谢性疾病有密切关系，如阿尔茨海默病、2型糖尿病、动脉粥样硬化等［8－9］。但是，迄今为止NLRP3炎症小体的具体运作模式尚不清楚。笔者通过盲肠结扎穿孔(Cecal ligation and puncture，CLP)模型构建大鼠脓毒症AKI模型并使用相关分子生物学手段，初步研究证实了NLRP3炎症小体在大鼠脓毒症AKI过程中的作用，探讨其防治脓毒症所致AKI的可能机制。

1 材料与方法

1．1 药品与试剂 Trizol试剂购自美国Invitrogen公司;考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒，购自北京普利来公司;大鼠尿素氮(BUN)和血清肌酐(Scr)试剂盒，购自南京建成生物工程研究所;苏木精和伊红，购自中国医药上海化学试剂公司;兔抗鼠多克隆抗体NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、IL-18 和 β-actin均购自美国Abcam公司;大鼠血清IL-1β和IL-18 ELISA检测试剂盒购自美国R＆D公司。

1．2 动物及分组 健康雄性SD大鼠48只，7～8周龄，体质量250～300 g。所有大鼠适应性饲养1周后随机分为假手术组(n=18)和CLP组(n=30)，2组再随机平均分为6个时间点(0、3、6、12、18、24 h)。

1．3 模型制备 采用盲肠结扎穿孔(CLP)法制备脓毒症模型。大鼠腹腔内注射10%水合氯醛溶液(3．5 ml/kg)麻醉，腹壁正中切开2 cm，拉出盲肠后在盲肠总长度50%处结扎，用25号针头在结扎线下5 mm处贯穿盲肠1次后放回盲肠并关腹。假手术组除不结扎和盲肠穿刺外，其余操作同CLP组。术后将大鼠分笼饲养，禁食不禁水。

1．4 样本采集 各组在相应时间点摘除存活大鼠眼球取血2 ml，以3 000 r/min离心10 min后留取血清备用。大鼠处死后，开腹，开放肾静脉，用4℃的生理盐水由腹主动脉注入肾脏冲洗，直至肾脏变白，取右肾组织，用锡箔纸包好后置入液氮罐中，冷冻保存，备用。

1．5 检测指标 采用ELISA法严格按照试剂盒说明书检测血清BUN、Scr、IL-1β和IL-18水平;取相同肾组织，苏木素伊红(HE)染色后，使用光学显微镜观察其病理学改变;将冷冻的肾组织制备成组织匀浆后，使用考马斯亮蓝法(Bradford)检测蛋白质含量，采用Western Blot法检测肾组织匀浆NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β 和IL-18 的表达量，并检测目标蛋白及内参β－actin条带的光密度比值，半定量分析其表达情况。

1．6 数据统计与分析 试验结果均以均值±标准差表示，使用SPSS16．0统计软件包对试验数据进行统计与分析。不同组间的差异采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，P＜0．05表示差异有统计学意义。

2 结果与分析

2．1 肾功能变化 从图1可以看出，与假手术组相比，CLP组在手术后3 h血清中BUN和Scr的表达出现增高，6 h差异显著(P＜0．05)，随着手术后时间的延长呈现出逐渐递增的趋势，24 h达到最高值(P ＜0．01)。

2．2 肾组织的病理学变化 从图2可以看出，术后24 h假手术组大鼠的肾小球结构基本正常;CLP组大鼠术后12 h肾小管上皮细胞肿胀，肾间质炎症细胞浸润;CLP术后24 h皮髓质交界处近端小管坏死显著，弥漫性细胞崩解及坏死，损伤进一步加重。

2．3 肾组织NLRP3/ASC/caspase-1/IL-1β/IL-18的表达变化 采用Western blot法检测了假手术组术后24 h以及CLP组术后0、6、12、18和24 h大鼠肾组织中NLRP3的表达情况。从图3可以看出，CLP组NLRP3的表达均高于假手术组。与假手术组相比，CLP术后6 h差异显著(P＜0．05)，12、18和24 h呈极显著性差异(P＜0．01)，其中18 h表达量最高。

2．4 肾组织ASC/caspase-1/IL-1β/IL-18的表达变化 采用Western blot法检测了假手术组术后24 h以及CLP组术后12 h和24 h大鼠肾组织中ASC/caspase-1/IL-1β/IL-18的表达情况。从图4可以看出，与假手术组相比，CLP术后12 h和24 h均差异极显著(P＜0．01或P＜0．001)。

2．5 血清中IL-1β和IL-18水平的变化 ELISA检测结果表明，与假手术组相比CLP术后12 h和24 h大鼠血清IL-1β和IL-18水平均差异极显著(IL-1β为P＜0．01;IL-18为P＜0．001)(图5)。

3 讨论

AKI是一种较常见的临床综合征，可发于医院各大科室 。感染导致脓毒症是引起AKI最重要的因素之一［2，10］。研究脓毒症AKI过程中分子水平的变化，有利于寻找防治脓毒症所致AKI的药物靶点，从而降低其病死率。

该试验采用CLP法制备大鼠脓毒症模型，即目前公认的与临床相关性较强的脓毒症模型［11］。该试验中脓毒症大鼠术后6 h血清BUN和Scr水平显著高于假手术组，并且随着时间的延长呈递增趋势;病理学检测发现，脓毒症大鼠术后24 h肾小管上皮细胞变性，皮髓质交界处近端小管坏死显著，表明脓毒症可导致AKI，并且随着时间的延长而损伤加重。

机体在天然的免疫系统的帮助下，可以快速识别外来的多种非特异性损伤，而模式识别受体则是天然免疫细胞激活的必要条件［12－13］。近年来，作为胞质内模式识别体的NLRP3炎症小体与损伤的密切关系日益受到广泛关注。NLRP3被激活后形成的NLRP3炎症小体，可剪切活化caspase-1蛋白前体，细胞可以产生和释放有生物活性的IL-1β和IL-18。IL-1β和IL-18都属于IL-1超家族，主要由单核巨噬细胞分泌，作为机体内重要的细胞因子，IL-1β和IL-18作用于免疫相关细胞，促使这些细胞产生相应的免疫效应［14］。

研究表明，机体的多种炎症反应(如动脉粥样硬化、糖尿病等)都存在 NLRP3/ASC/caspase-1/IL-1β/IL-18轴的紊乱［15－16］。该研究中CLP组大鼠肾组织NLRP3/ASC/caspase-1/IL-1β/IL-18和血清IL-1β/IL-18水平均显著升高，且随着术后时间的延长而递增，表明脓毒症引起的AKI可能与激活NLRP3/ASC/caspase-1/IL-1β/IL-18轴有关，而抑制 NLRP3的激活可能有助于减轻脓毒症AKI的发生和发展。该研究结果为脓毒症AKI的防治提供试验基础。

［1］王俊峰．2007－2014年我国药物性急性肾损伤文献调查与分析［J］．临床误诊误治，2014(10):54 －57．

［2］ZARBCK A，GOME H，KELLUM J A．Sepsis-induced acute kidney injury revisited:Pathophysiology，prevention and future therapies［J］．Curr Opin Crit Care，2014，20:588 －595．

［3］宋雨薇，柴艳芬．脓毒症并发急性肾损伤患者临床特征及危险因素分析［J］．中华临床医师杂志，2015(9):391 －394．

［4］郭琳瑛．脓毒症致急性肾损伤的早期识别［J］．中华实用儿科临床杂志，2008，30(6):401 －404．

［5］BASILE D P，ANDERSON M D，SUTTON T A．Pathophysiology of acute kidney injury［J］．Compr Physiol，2012，2:1303 －1353．

［6］SCHRODER K，TSCHOPP J．The inflammasomes［J］．Cell，2010，140:821－832．

［7］SCHRODER K，ZHOU R，TSCHOPPJ．The nlrp3 inflammasome:A sensor for metabolic danger［J］．Science，2010，327:296 －300．

［8］SHIGEOKA A A，MUELLER J L，KAMBO A，et al．An inflammasome-independent role for epithelial-expressed nlrp3 in renal ischemia-reperfusion injury［J］．JImmunol，2010，185:6277 －6285．

［9］VILAYSANE A，CHUN J，SEAMONE M E，et al．The nlrp3 inflammasome promotes renal inflammation and contributes to ckd［J］．JAm Soc Nephrol，2010，21:1732 －1742．

［10］GOWDA S，DESAI PB，KULKARNI SS，et al．Markers of renal function tests［J］．N Am JMed Sci，2010，2:170 －173．

［11］金魁，刘宝，邵敏，等．小鼠脓毒症急性肾损伤模型制备及肾功能损伤指标评价［J］．中国急救医学，2015(3):394 －397．

［12］AKCAY A，NGUYEN Q，EDELSTEIN CL．Mediators of inflammation in acute kidney injury［J］．Mediators Inflamm，2009，2009:137072．

［13］MELNIKOV V Y，FAUBEL S，SIEGMUND B，et al．Neutrophil-independent mechanisms of caspase-1-and il-18-mediated ischemic acute tubular necrosis in mice［J］．JClin Invest，2002，110:1083 －1091．

［14］DUEWELL P，KONO H，RAYNER K J，et al．Nlrp3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals［J］．Nature，2010，464:1357 －1361．

［15］ALLEN I C，TEKIPPE E M，WOODFORD R M，et al．The nlrp3 inflammasome functions as a negative regulator of tumorigenesis during colitisassociated cancer［J］．JExp Med，2010，207:1045 －1056．

［16］李金凤，谢笛，何平平，等．Nlrp3炎性体与代谢性疾病的研究进展［J］．生物化学与生物物理进展，2014，41(5):425 －434．