淀粉质食品中蜡样芽孢杆菌的分离鉴定

张 锋，于 倩，徐 艳，顾 敏，杨 静

(甘肃省分析测试中心，甘肃兰州 730000)

淀粉质食品中蜡样芽孢杆菌的分离鉴定

张 锋，于 倩*，徐 艳，顾 敏，杨 静

(甘肃省分析测试中心，甘肃兰州 730000)

[目的]分离鉴定淀粉质食品中的蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)。[方法]以淀粉质食品(低温保藏的米饭)为原料，采用传统方法对米饭中蜡样芽孢杆菌进行分离鉴定，使用PCR技术做最终确定。[结果] 对低温保藏米饭进行系列稀释后在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板上进行菌种分离，初步分离出菌株MF-2，表面光滑稍有光泽，呈现低凸起形，边缘呈现锯齿状，菌落形状可形成近似圆形、质地松软、无色素，菌落颜色为乳白色不透明；经革兰氏染色为阳性，镜检为杆状；经芽孢染色为有芽孢杆菌； MF-2号菌能利用葡萄糖、蔗糖和麦芽糖，并产酸，但不能分解D-甘露糖和α-乳糖,初步鉴定菌株MF-2为蜡样芽孢杆菌。由16S rRNA基因序列同源性分析，结合形态观察和生理生化鉴定，最终鉴定该菌株为蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)。 [结论] 研究可为食品质量安全提供理论和实践依据。

蜡样芽孢杆菌；PCR技术；分离；鉴定

蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)是一种革兰氏阳性杆菌，能形成芽孢，在周围环境中广为存在，其中一些菌株极易污染食物而引起食物中毒，特别是在蛋白质和碳水化合物含量丰富的食品中，如乳类、米饭、奶制品、腐乳、鱼、烧鸡等。因食品没有明显的腐败现象，除有时稍有发粘口感不爽外，感官基本正常，因此不易察觉，误食几率较大。此类蜡样芽孢杆菌主要引起8种类型的食物中毒症状，主要表现为呕吐及腹泻症状；此外，它们还能引起伤口及眼睛的感染等其他一些非肠胃性感染[l-2]。

目前，我国对蜡样芽孢杆菌采用的检测方法为国家标准GB.14938-94及检验检疫系统行业标准WS/T.82-1996[3]。整个检测过程费时低效，造成货物积压，货主经济损失增大[4]。而PCR技术现已广泛应用于生物及食品学科等众多领域，尤其是在食品中致病微生物检测方面具有很大的应用价值[5]。实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且采用全密闭管检测，不需后处理，避免交叉污染，具有特异性强、自动化程度高的特点[6]，并可有效解决PCR污染问题；PCR与其他的分子生物学技术的联合应用[7]，使人们可定性、定量研究微生物菌落结构组成及数量变化，深入探索微生物菌落与环境因子之间的相互作用及其动态变化过程，为全面快速准确地分析鉴定水体、空气、土壤和食品等环境中的各种微生物提供了一种崭新的技术工具和平台。为此，笔者以淀粉质食品为来源采用PCR技术对其可能含有的蜡样芽孢杆菌进行分离鉴定，以期为食品质量安全提供理论和实践依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1供试原料。米饭冷却后在冰箱中冷藏2 d后备用。

1.1.2主要试剂。氯化钠、氢氧化钠，广东省化学试剂工程技术研究开发中心，分析纯；牛肉膏、蛋白胨、琼脂，石家市旭瑞化工有限公司；1.6%溴甲酚紫乙醇溶液；革兰氏染色：草酸铵结晶紫染液，碘液，95%乙醇溶液，番红染色液；芽孢染色：5%孔雀绿水溶液，0.5%番红染色液。

1.1.3主要仪器与设备。生化培养箱(SPX-250B-2)、数显不锈钢电热培养箱(HPX-9272MBE)，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；电热恒温培养箱(DNP-9272)，上海精宏实验设备有限公司；手提式压力蒸汽消毒器(YXQ·SG4b·280A)，上海医用核子仪器厂；超净工作台(SW-CJ-100)，苏州安泰空气技术公司；干燥箱(GRX20)，上海精密科学仪器有限公司；水浴恒温振荡器(SHA-B)，金坛市医疗仪器厂；显微镜(XS-213A)，南京江南光电股份有限公司；紫外可见分光光度计(UVmini-1240)，尤尼柯(上海)有限公司；凝胶成像系统(BIO-RAD)，美国伯乐；PCR仪(TC-512)，英国TECHNE。

1.2 方法

1.2.1培养基的配制。

1.2.1.1主要培养基。牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。成分：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化钠10 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 ml，pH 7.6～7.8。制法：将除琼脂以外在各成分溶解于水中，以NaOH溶液校正pH 7.6～7.8，分装三角瓶(分装以三角瓶容积的1/2～2/3为宜)，而后按培养基的量加入2%在琼脂，0.1 MPa灭菌20 min后倒平板备用。

1.2.1.2细菌糖发酵培养基。糖发酵试验——用于鉴定一般细菌糖或醇发酵试验。成分：蛋白胨10 g，氯化钠5 g，磷酸氢二钾0.2 g，蒸馏水1 000 ml，pH 7.4，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液(BCP)1～2 ml，葡萄糖(或其他糖、醇，如：D-甘露糖、蔗糖、α-乳糖、麦芽糖)10 g。制法：将蛋白胨、氯化钠和磷酸氢二钾溶于蒸馏水中，校正pH，加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液，待呈紫色，在加入葡萄糖(或其他各糖)，使之溶解，分装于试管中，最后将杜氏小管倒置放入试管中，使管内充满培养液无气泡。

1.2.2菌种的分离培养。

1.2.2.1制备稀释液。 称取米饭10 g，放置于盛有90 ml无菌生理盐水并带有玻璃珠的三角瓶中，在水浴恒温振荡器中振荡约2 h，使米饭与水充分混合，使细胞分散，即成为10-1稀释度的米饭悬液；用移液枪吸取1 ml 10-1稀释度的米饭悬液放入9 ml无菌生理盐水混合均匀，即成为10-2稀释度的米饭悬液；在用移液枪吸取1 ml 10-2稀释度的米饭悬液放入9 ml无菌生理盐水混合均匀，即成为10-3稀释度的米饭悬液。如此反复，连续稀释可依次制成10-3～10-7不同稀释度的米饭稀释液。

1.2.2.2平板接种培养。①倒平板：取无菌平皿6套，分别用记号笔标明10-4～10-6稀释度各2套。取灭菌后冷却至不烫手的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，分别倒入相应标号的无菌平皿约15 ml，平放桌上待凝固。②涂布平板：用移液枪分别吸取10-4～10-6稀释度的米饭悬液各0.1 ml，倾注于相应标号的无菌平皿中，火焰旁左手拿培养皿，并用拇指将皿盖打开一缝，右手持无菌玻璃涂棒，于平板培养基表面，将菌悬液自平板中央以同心圆方向轻轻向外涂布扩散，使之均匀分布。室温下静置5～10 min，使菌液侵入培养基，每个稀释度接种2个平板。③培养：将接种的牛肉膏蛋白胨平板倒置于37 ℃恒温培养箱中培养1～2 d。

1.2.2.3革兰氏染色。革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染4个步骤。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色(红色)，则该菌属于革兰氏阴性菌。

1.2.2.4芽孢染色。芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，因此，当先用弱碱性染料，如孔雀绿或碱性品在加热条件下进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出，若再用复染液(如番红液)或衬托溶液(如黑色素溶液)处理，则菌体和芽孢易于区分。

1.2.3菌株生长曲线的测定与绘制。将分离的3种菌株(MF-1、MF-2、MF-3)分别接种入装有牛肉膏蛋白胨培养液的三角瓶中，在37 ℃恒温振荡培养，分别在0、2、3、4、5、6、7、8、9 h…取出，以未接种培养液调零点，将摇匀后的培养液倒入比色槽中测定其OD600值。

1.2.4糖发酵试验。蜡样芽孢杆菌菌种的鉴定主要是依据菌株对碳水化合物的发酵产酸试验，即通过对糖、糖苷和糖醇类等碳水化合物的利用情况来区分。如果发酵管中加入糖，培养2～3 d后，培养液出现黄色，则表示该糖被利用并产酸，反应为阳性；如无任何变化者则表示该糖不被利用，反应为阴性。

该试验进行下列糖的糖发酵试验: 葡萄糖、D-甘露糖、蔗糖、α-乳糖、麦芽糖。将糖发酵培养基成分(指示剂除外)称取、溶解、摇匀，调整pH，添加1.6%溴甲酚紫指示剂，按1%的浓度添加试验糖类并溶解，分装试管，每管5 ml，在121 ℃下高压灭菌30 min，冷却至室温后待用。取分离出的3个菌株分别接种于糖发酵培养基中进行糖发酵试验，另外做空白试验对照，接种后，放置于37 ℃恒温培养箱中培养48 h，观察结果。

1.2.516S rRNA基因序列同源性分析。

1.2.5.1模板的制备。收集1.5 ml对数生长期细菌细胞；在10 000 r/min离心5 min，去除上清液；用TE缓冲液冲洗2次，加TE缓冲液0.5 ml，振荡，最终重新悬浮于1.5 ml的离心管中。细胞颗粒溶于500 μl TE缓冲液中并混匀，加入10 μl溶菌酶，在37 ℃水浴锅中加热20～30 min；加30 μl 10% SDS，5 μl蛋白酶K，混匀，在55 ℃水浴中加热30 min；加100 μl NaCl (5 mol/L)混匀，再加80 μl的CTAB/NaCl混匀；55 ℃水浴10 min。加入等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液，混匀(如果分层不明显，则重复此步骤)，在10 000 r/min离心10 min去除上清液，加入2倍体积的95%乙醇和0.1倍体积的醋酸钠，在4 ℃冰箱中放置一个晚上，然后在10 000 r/min高速离心10 min，去除上清液，用70%乙醇冲洗2次，再加入200 μl TE缓冲液。

1.2.5.216S rRNA基因PCR扩增。 试剂：TaqDNA聚合酶，购自TaKaRa公司；引物：由上海生工有限公司合成；27f 5-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3(对应于E.coli的16S rRNA的第8～27碱基位置)；1492r 5-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3(对应于E.coli的16S rRNA的1479～1492碱基位置)。

PCR反应体系(50 μl)：DNA模板(30～50 ng)，3 μl；dNTP混合物(终浓度:200 μmol),1 μl;TaqDNA聚合酶(1U),0.5 μl; 引物1为0.4 μmol，1 μl；引物2为0.4 μmol，1 μl；TaqDNA聚合酶10×缓冲液,5 μl;MgCl2，2 mmol/L,1 μl; 去离子水,37 μl。

1.2.5.3PCR产物检测。3 μl扩增产物在1%琼脂糖、50 μg/ml EB凝胶电泳上检测，16S rRNA 基因大约1 450 bp，正向测序约700 bp。电泳结束后，置于BIO-RAD凝胶成像仪照相，保存为TIFF文件格式。

1.2.5.4PCR产物纯化、测序[8-10]。 采用AxyprepTMPCR Cleanup Kit 纯化PCR产物，扩增产物由上海生工生物技术有限公司进行测序。

1.2.5.5数据处理。将所测得的16S rDNA序列用提交到GenBank数据库中，用BLAST进行相关序列的搜索，与GenBank、EMBL、DDBJ等数据库中现有的近缘菌株的序列比较，并从数据库获得相关属、相关种的16S rDNA序列，建立系统发育树。序列用CLUSTAL X program软件对齐，进化距离的计算应用邻接法neighbor-joining method，采用p-distances法和Kimura-2parameter双参数法进行，进化树分支模式的稳定性用MEGA v.4.1软件分析，采用bootstrap法，重复次数为1 000，构建进化树。

2 结果与分析

2.1 纯化培养(挑取单菌落)菌落特征的观察和选择：采用平板分离培养法长出的肉眼可见菌落，不同菌株的菌落形态特征各异，据此可在一定程度上鉴别微生物。从分离平板中选择目的菌株的菌落进行纯化培养。观察菌落特征主要有：大小、表面形状、隆起度、边缘性状、菌落性状、表面光泽、菌落质地、颜色、透明度等。由此分离出3种菌株(MF-1、MF-2、MF-3)。

在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取菌悬液一环在培养基平板上划线，划线完毕，将牛肉膏蛋白胨平板倒置于37 ℃恒温培养箱中培养1～2 d。培养后在划线平板上观察沿划线处长出的菌落形态特征，经涂片、染色和镜检为纯种后再接种斜面。

菌落形态如图1所示。MF-1：菌落为小菌落(2～3 mm)，表面光滑具有光泽，呈现低凸起形，边缘整齐可形成圆形或近似圆形、质地松软、无色素，菌落颜色为乳白色偏黄不透明。MF-2：菌落为小菌落(2～3 mm)，表面光滑稍有光泽，呈现低凸起形，边缘呈现锯齿状，菌落形状可形成近似圆形、质地松软、无色素，菌落颜色为乳白色不透明。MF-3：菌落为小菌落(2～3 mm)，表面光滑稍有光泽，呈现低凸起形，边缘呈现锯齿状，菌落形状可形成近似圆形、质地松软、无色素，菌落颜色为乳白色不透明。

2.2 革兰氏染色涂片→干燥→固定→草酸铵结晶紫染液初染(1～2 min)→水洗→碘液媒染(1 min)→水洗→95%乙醇溶液脱色(30 s)→水洗→番红复染(1～2 min)→水洗→滤纸吸干→镜检。

经革兰氏染色，MF-1号菌呈现红色，故为革兰氏阴性菌，MF-2号菌和MF-3号菌呈现紫色，故为革兰氏阳性菌(图2)；且3种菌株都呈现为杆状，故为杆菌。

2.3 芽孢染色制备菌悬液→染色(5%孔雀绿水溶液加热染色15～20 min)→涂片、固定→脱色(水洗)→复染(0.5%番红染色液染色2～3 min，倾去染液滤纸吸干)→镜检。

经芽孢染色后，MF-2号菌呈现为杆状，芽孢为绿色，菌体为红色，故为芽孢菌；MF-3号菌呈现为杆状，均为红色，故无芽孢(图3)。

2.4 菌株生长曲线的测定与绘制以细菌悬液的光密度值(OD值)为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制出MF-2号菌的生长曲线，见图4。

2.5 糖发酵试验葡萄糖、蔗糖和麦芽糖发酵管颜色由原来的紫色变为黄色，则表示MF-2号菌能利用葡萄糖、蔗糖和麦芽糖，并产酸；D-甘露糖和α-乳糖发酵管颜色为紫色，没有变化，则表示MF-2号菌不能分解D-甘露糖和α-乳糖(表1，图5)。

表1 MF-2号菌糖发酵试验测定结果

培养基及试验MF-2号菌结果葡萄糖+蔗糖+D-甘露糖-α-乳糖-麦芽糖+

注：“+”，“-”分别表示糖发酵试验反应结果为阳性和阴性。

2.6 16S rRNA基因序列同源性分析DNA杂交后，同源性在70%以上属于种的水平；在20%以上，所试验的菌株可能属于同一个属的成员。16S rRNA基因序列分析法原理是：如果两株细菌的亲缘关系比较接近，那么它们的rRNA序列同源性比较高，一般认为序列同源性超过97.5%以上为同一个种。

对分离菌株进行PCR扩增得到菌株的16S rDNA，经过电泳检测(图6)，由上海生工公司测序，将所测得的16S rDNA序列提交到GenBank数据库中，用BLAST进行相关序列的搜索，与GenBank、EMBL、DDBJ等数据库中现有的近缘菌株的序列比较，并从数据库获得相关属、相关种的16S rDNA序列，建立系统发育树(图7)。结果表明，菌株MF-2与蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)同源性达98%。根据分子生物学测序结果，结合形态观察和生理生化现象，鉴定该菌株为蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)。

3 结论

对低温保藏米饭进行系列稀释后在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板上进行菌种分离，初步分离出菌株MF-2，表面光滑稍有光泽，呈现低凸起形，边缘呈现锯齿状，菌落形状可形成近似圆形、质地松软、无色素，菌落颜色为乳白色不透明；经革兰氏染色为阳性，镜检为杆状；经芽孢染色为有芽孢杆菌； MF-2号菌能利用葡萄糖、蔗糖和麦芽糖，并产酸，但不能分解D-甘露糖和α-乳糖。参照《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》,初步鉴定菌株MF-2为蜡样芽孢杆菌。

由16S rRNA基因序列同源性分析，结合形态观察和生理生化鉴定，最终鉴定该菌株为蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)。

[1] IROSHI FUKUSHIMA,YOSHIE TSUNOMORI,RYOTARO SEKI.DuPlex rea-time SYBR green PCR assays for deteetion of 17 species of food or water borne patho gens in stools[J].Journal of Clinical Microbiolog,2003,41(11):5134-5146.

[2] RUDI K, HOIDAL H K, KATLA T,et al.Ditect Real-time PCR quantification of Carnpylobacter jejuni in chicken fecal and cecal samples by intergrated cell concenteation and DNA Purification[J].Appl Environmental Microbiol, 2004,7(2):790-798.

[3] BACH H J,ERRARNPALLI D,LEUNG K T,et al. Specifie detection of the gene for the extra cellular neutral protease ofBacilluscereusby PCR and blot hybridization [J].Applied and Environmental Microbiology, 1999, 65(7): 3226-3228.

[4] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB4789.14-2003,食品卫生微生物学检验——芽孢杆菌检验标准[S].北京:中国标准出版社,2003.

[5] BJATNE MUNK HANSEN,NIELS BOHSE HENDRIKSEN.Detection of enterotoxicBacilIuscereusandBacillusthuringiensisstrains by PCR analysis[J].Applied and Environmental Microbiology,2001，67(1):185-189.

[6] YANG I O,SHIH D Y,HUAMG T P,et al.Establishlment of a novel multiplex PCR assay and detection of toxigenic strains of the species in the Baeillus cereus group[J]. Food Protect, 2005,68(10):2123-2130.

[7] 王振国,刘金华,徐宝梁,等.应用实时荧光PCR检测致病性芽孢杆菌[J].生物技术通讯,2006,17(l):40-42.

[8] KOTIRANTA A,LOUNATMAA K,HAAPASALO M.EPidemiology and Pathogenesis ofBacilluscereusinfeetions[J].Microbes Infeot,2000,2(2):189-198.

[9] 孟灵,王应芳,李恕君.骨髓及血液中检出芽孢杆菌1例[J].检验医学与临床，2007, 4(5):435-436.

[10] 沈圣,余娟,滕毅,等.TaqManTM实时荧光 PCR快速检测芽孢杆菌的初步研究[J].中国卫生检验杂志,2006,16(12):1434-1436.

Isolation and Identification ofBacilluscereusin Starches

ZHANG Feng, YU Qian*, XU Yan et al

(Gansu Analysis Research Center, Lanzhou, Gansu 730000)

[Objective] To isolate and identificateBacilluscereusin starches. [Method] With starchy food(low temperature preservation steamed rice) as raw material, traditional method was adopted to isolate and identifyBacilluscereusin steamed rice, PCR technology was used for final determination. [Result] A sequence of dilution was conducted on low temperature preservation steamed rice, and bacteria isolation was carried out on beef extract peptone agar medium. MF-2 was preliminarily isolated. MF-2 bacteria could utilize glucose, sucrose and maltose, produce acid, but can not degrade D- galactose and lactose. Through 16S rRNA gene sequence homology analysis, combined with morphological observation and physiological and biochemical identification,Bacilluscereuswas identified finally. [Conclusion] The study can provide theoretical and practical basis for food quality safety.

Bacilluscereus; PCR technique; Isolation; Identification

张锋(1981-)，男，甘肃庆阳人，助理研究员，从事食品科学、食品检测研究。*通讯作者，硕士，从事农产品贮藏及加工、食品检测研究。

2015-03-26

S 182

A

0517-6611(2015)13-263-04