有机酸对牛肉原料表面致病菌的清洗抑制研究

郭 岩，成玉梁，姚卫蓉，谢云飞，钱 和

(江南大学食品学院，江苏无锡 214122)

有机酸对牛肉原料表面致病菌的清洗抑制研究

郭 岩，成玉梁，姚卫蓉，谢云飞，钱 和*

(江南大学食品学院，江苏无锡 214122)

[目的]筛选对牛肉原料表面致病菌经济有效的有机酸清洗方法。[方法]以降低接种牛肉原料表面致病菌残留量以及残留致病菌在4 ℃储藏期间生长抑制程度为指标，筛选出适宜的有机酸清洗剂种类及浓度。[结果]试验得出，1%乳酸对接种牛肉表面致病菌的清洗效果最好，1%乙酸对储藏期间残留致病菌的抑制效果最好。[结论]研究可为牛肉制品生产过程中原料致病菌的控制提供理论指导。

致病菌；有机酸；牛肉原料；清洗；抑制

酱卤、腌制肉制品等即食食品因其方便美味越来越受到人们的喜爱，但在其加工环节，由于缺少有效的清洗措施，在加工滞后时间内易受到微生物污染，很容易引起微生物的繁殖，甚至引起食源性疾病，是易发生食品中毒的“高危食品”[1]。常见的污染微生物有大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌等食源性致病菌。在我国，大肠杆菌是引起我国居民腹泻的首要病源[2]；金黄色葡萄球菌在自然界中广泛分布，食品污染后不仅腐败变质，还有部分菌株可产生肠毒素[3]；单增李斯特菌在自然界广泛分布且可以在低温环境条件下生长繁殖，人类感染单增李斯特菌的疾病致死率为20%～30%，并有严重的临床症状[4]。

研究表明，有机酸可以降低食品中水分的pH，有溶解细菌细胞膜的作用，在防腐抑菌方面应用十分广泛[5]。特别是低分子有机酸能透过微生物细胞膜进入细胞内部而离解，改变细胞内的电荷分布，导致细胞代谢紊乱或死亡，对多数细菌均有效[6]。高彩霞等[7]、李清秀等[8]、马艳丽等[9]也报道了乳酸、乙酸、柠檬酸等常见有机酸对不同载体表面常见致病菌的抑菌作用。但有机酸作为清洗剂对致病菌的清洗及抑菌效果的研究并不多见。

笔者以酱牛肉原料为载体，筛选对接种牛肉原料表面的单核细胞增生李斯特菌(L.mono)、金黄色葡萄球菌(S.aure)与大肠杆菌(E.coli)有较好清洗效果及抑制效果的有机酸，得到一种经济有效低浓度的牛肉原料清洗处理方法，此方法有残留低的优点，从而为从源头上控制原料中致病菌的污染提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1研究对象。新鲜牛肉黄瓜条，购自江苏无锡华润万家超市；单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)，均由江南大学食品安全与质量控制实验室自分离提供。

1.1.2主要试剂。乳酸(LA)、乳酸钠、乙酸(AA)、乙酸钠、柠檬酸(CA)、柠檬酸钠、双乙酸钠(SD)，均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；营养肉汤培养基、PALCAM培养基、Baird-Paker琼脂、结晶紫中性红胆盐琼脂VRBA，均购自北京路桥技术有限责任公司。

1.1.3主要仪器。立式圆形压力蒸汽灭菌器，上海医用核子仪器厂；BSC系列生物安全柜，北京东联哈尔仪器制造有限公司；隔水式电热恒温培养箱，上海跃进医疗器械厂。

1.2 方法

1.2.1有机酸对牛肉原料表面接种致病菌的清洗效果。

1.2.1.1微生物接种液制备。将甘油保藏的单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌与大肠杆菌用营养肉汤培养基活化并传代2次，斜面保存于4 ℃冰箱中，使用时用接种环挑起分别接种到肉汤培养基中，37 ℃摇床培养24 h，取1 ml离心获取细胞，用无菌生理盐水稀释至108CFU/ml，备用。

1.2.1.2样品制备及接种。将新鲜的牛肉黄瓜条洗净，切成5 cm×10 cm，厚2 cm的薄片(两个侧面的表面积之和为100 cm2)。接种时用无菌玻璃棒向样品的两侧表面分别涂抹上述接种液1 ml，涂抹均匀后用经酒精消毒的无菌锡纸包裹，4 ℃下放置20 min，使接种液与牛肉充分接触[10]，牛肉表面的接种浓度为106CFU/cm2。

1.2.1.3有机酸溶液制备与样品处理。将乳酸、乙酸用蒸馏水分别配制成0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%(V/V)的溶液各100 ml(分别加入适量的对应盐类使溶液pH>3.5),柠檬酸、双乙酸钠用蒸馏水配制成质量分数为0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的溶液各100 ml。高温高压灭菌(121 ℃，15 min)，冷却至室温待用。在无菌条件下，将接种后的牛肉与有机酸溶液同时放入无菌袋中，常温下轻微振荡，60 s之后将牛肉迅速取出，沥水后放入含有50 ml无菌MRD缓冲液(0.1%蛋白胨和8.5%NaCl)的无菌袋中,摇晃30次，使细菌细胞分散[10]。

1.2.1.4致病菌残留量计数。取各组缓冲液1 ml分别用无菌生理盐水梯度稀释至适宜浓度，在无菌操作条件下，取0.1 ml表面涂布于PALCAM琼脂培养基(单增李斯特菌)、Baird-Paker琼脂培养基(金黄色葡萄球菌)和结晶紫中性红胆盐琼脂VRBA培养基(大肠杆菌)，37 ℃培养24～48 h，分别计数残留致病菌数量(CFU/cm2)，换算成log CFU/cm2。每组3次平行。

1.2.2有机酸清洗牛肉原料后对表面接种致病菌的抑制效果。

1.2.2.1有机酸溶液配制与样品处理。根据“1.2.1”的筛选结果，配制1%(V/V)的乳酸和乙酸溶液(调pH>3.5)。将配置好的有机酸溶液与蒸馏水对照组高压灭菌(121 ℃，15 min)，冷却至室温。将新鲜的牛肉黄瓜条洗净，切成5 cm×10 cm，厚2 cm的薄片(两个侧面的表面积之和为100 cm2)若干，分为3组，每组15个样品。在无菌条件下将每组处理好的牛肉黄瓜条与清洗液同时放入无菌袋中，常温下轻微振荡，60 s之后将牛肉迅速取出，无菌条件下室温放置20 min。将“1.2.1.1”的接种液用无菌生理盐水稀释至106CFU/ml，将清洗过的牛肉样品每组分别接种单核细胞增生李斯特菌×5、金黄色葡萄球菌×5及大肠杆菌×5。在无菌操作条件下用无菌玻璃棒分别向样品的两侧表面涂抹上述接种液1 ml，使牛肉表面的致病菌数量为104CFU/cm2。接种完毕放入无菌袋中，4 ℃条件下储藏。第2天分别将每组的每种致病菌样品取出一个，放入含有50 ml无菌MRD缓冲液的无菌袋中，摇晃30次，以使细菌细胞分散。此后每隔1周取样重复上述步骤[11]。

1.2.2.2残留致病菌数量计数。将各组缓冲液用无菌生理盐水梯度稀释至适宜浓度，在无菌操作条件下，表面涂布于各个选择性培养基中，37 ℃培养24～48 h，分别计数(CFU/cm2)，换算成log CFU/cm2。每组3次平行，得到4 ℃储藏条件下残留致病菌的生长抑制曲线。

1.2.3数据处理。试验数据采用SPSS17.0软件进行方差分析和显著性差异检验，用Origin8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 有机酸对接种牛肉原料致病菌的清洗效果

2.1.1单增李斯特菌的清洗效果。从图1可以看出，随着有机酸浓度的增大，单增菌的残留量呈下降趋势，浓度变化到1.0%时，下降的趋势较明显，浓度再增大时，下降趋势变的平缓。从有机酸的类型来看，乳酸清洗效果最好，乙酸次之，双乙酸钠与乙酸清洗效果相当，柠檬酸对单增菌的清除能力最弱。考虑到工厂实际操作的经济适用原则及GB2760中有关双乙酸钠添加限量的规定，1.0%(V/V)的乳酸为适宜的清洗剂。

2.1.2金黄色葡萄球菌的清洗效果。由图2可知，随有机酸溶液浓度的增大，金黄色葡萄球菌的残留量整体呈下降趋势。就有机酸的种类来说，清洗效果最好的仍是乳酸和乙酸，1.0%乳酸清洗时残留量达到最低值，1.5%乙酸清洗时残留量达到最低值，此后的趋势逐渐变缓。因此，1.0%乳酸为适宜清洗剂。

2.1.3大肠杆菌的清洗效果。从图3可以看出，随有机酸浓度的增大，大肠杆菌的残留量呈整体下降趋势。乳酸与乙酸的清洗效果在1.0%处达到最佳值，柠檬酸与双乙酸钠在2.0%处达到最低值。就残留量来说，乳酸与乙酸的清洗效果远优于柠檬酸与双乙酸钠，并且在较低浓度时就可以达到较好的请效果，故1.0%乳酸为适宜清洗剂。

2.1.4最适清洗剂及其浓度的确定。从表1可以看出，初始接种量为6 log CFU/cm2，对照组的致病菌残留量在5.3 log CFU/cm2左右，表明蒸馏水的物理移除清洗效果为0.7 log CFU/cm2。与蒸馏水对照组相比，1.0%乳酸可将单增李斯特菌的残留量降低0.789 log CFU/cm2，与对照组及其他酸洗组的单增李斯特菌残留量相比均有显著性差异(P<0.05)，1.0%乙酸组与对照组及1.0%柠檬酸组的单增李斯特菌残留量相比也均呈显著性差异(P<0.05)，但与1.0%双乙酸钠组单增菌残留量相比无显著差异(P>0.05)。与对照组相比，1.0%乳酸可将金黄色葡萄球菌残留量降低1.217 log CFU/cm2，而其他有机酸组与对照组相比金葡菌残留量的数量降低均小于1 log CFU/cm2。1.0%乳酸对金黄色葡萄球菌的清洗效果与其他组相比差异显著(P<0.05)。与对照组相比，1.0%乳酸将大肠杆菌残留量降低了1 log CFU/cm2，下降幅度大于其他有机酸组，且1.0%乳酸组对大肠杆菌的清洗效果与对照组及其他有机酸组相比效果显著(P<0.05)。验证了Ga-Hee Ban等的研究结果[12]。由此可知，有机酸对致病菌的清洗效果为乳酸>乙酸>双乙酸钠>柠檬酸，1.0%的乳酸和1.0%乙酸为适宜的牛肉原料清洗剂，能较好地降低接种牛肉原料表面的致病菌残留量。

表1 蒸馏水、1.0%乳酸、1.0%乙酸、1.0%双乙酸钠和1.0%柠檬酸清洗接种牛肉原料表面单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的残留量

清洗方式病原菌残留量∥logCFU/cm2单增李斯特菌金黄色葡萄球菌大肠杆菌综合效果logCFU/cm2蒸馏水5.2045.4475.3425.3311.0%乳酸4.4154.2304.3424.3291.0%乙酸4.7084.6024.4914.6001.0%柠檬酸4.9295.0094.9144.9511.0%双乙酸钠4.6904.9195.0414.883

2.2 1.0%乳酸和1.0%乙酸清洗牛肉原料后对表面接种致病菌的抑制效果

2.2.1单增李斯特菌的抑制效果。由图4可以看出，蒸馏水清洗的对照组(CK)在储藏的最初2周内，单增李斯特菌的数量增加了3.163 log CFU/cm2。而酸洗组对残留单增菌的生长有一定的抑制作用，其中1.0%乙酸组在4周内单增菌数量只增加了0.582 log CFU/cm2，与对照组及1.0%乳酸组相比抑制效果显著(P<0.05)。而1.0%乳酸组虽有抑制作用但抑制效果与对照组相比不显著(P>0.05)。故1.0%乙酸对单增李斯特菌的抑制效果优于1.0%乳酸。

2.2.2金黄色葡萄球菌的抑制效果。图5表明，对照组(CK)在储藏期间金黄色葡萄球菌的数量增加了3.361 log CFU/cm2。酸洗组与对照组相比，对金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用，但与对照组相比，1.0%乙酸的抑制效果不显著(P=0.073)。在储藏期间，1.0%乙酸组金黄色葡萄球菌的数量增加了1.339 log CFU/cm2，1.0%乳酸组金黄色葡萄球菌的数量则增加了2.174 log CFU/cm2。故乙酸对金黄色葡萄球菌的抑制效果仍优于乳酸。

2.2.3大肠杆菌的抑制效果。图6表明，对照组(CK)在储藏期间，大肠杆菌的数量增加了2.239 log CFU/cm2。1.0%乙酸组在储藏最初2周内大肠杆菌数量增加了0.222 log CFU/cm2，随后数量减少至3.491 log CFU/cm2，低于初始水平，与对照组和1.0%乳酸组相比，对大肠杆菌的抑制效果很显著(P<0.05)。1.0%乳酸组的抑制效果与对照组相比不显著(P>0.05)。故乙酸对大肠杆菌的抑制效果优于乳酸。

3 结论与讨论

研究结果表明，对于牛肉原料表面接种的单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌(106CFU/cm2),1.0%乳酸的清洗效果最好，与初始接种量相比可将致病菌残留量减少约2.0 Log CFU/cm2，与蒸馏水清洗相比可将致病菌残留数量降低约1.3 Log CFU/cm2。这可能是因为乳酸有较大的有效酸度[13]。对有机酸清洗后的牛肉原料表面接种致病菌(104CFU/cm2)，4 ℃条件下储藏，可以看出1.0%乙酸的抑菌效果最好。乙酸的酸性低于乳酸，其抑菌效果优于乳酸的原因可能是不同的酸性阴离子抑菌能力不同，有机酸对致病菌的抑制效果不仅仅取决于其储藏过程中残留的有效酸度，还与外部环境以及细菌对酸性阴离子的抗性不同等多种因素有关[14]。

牛肉制品加工过程中，原料致病菌的干预措施应将有机酸清洗与蒸汽杀菌、热水杀菌等方法结合起来，起到协同作用，可以更持续有效地控制原料牛肉的致病菌数量。

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Efficacy of Washing Beef Surface With Organic Acids for Pathogen Decontamination and Residual Growth Inhibition

GUO Yan, CHENG Yu-liang, YAO Wei-rong, QIAN He*et al

(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122)

[Objective] The paper aims to filter the cost effective organic acid cleaning method for pathogen on beef surface. [Method] We compared the decontamination and residual growth inhibition of 4 organic acids with different concentration and select the suitable type and concentration. [Result] 1% lactic acid is optimum for pathogen decontamination and 1% acetic acid is optimum for pathogen residues growth inhibition during the 4 ℃ storage condition. [Conclusion] The research provides theoretical guidance for raw materials pathogen control during the production process.

Pathogen; Organic acid; Raw material; Decontamination; Inhibition

国家“十二五”科技支撑计划(2014BAD04B03)。

郭岩(1991-)，女，山西运城人，硕士研究生，研究方向：食品安全与质量控制。*通讯作者，教授，博士，从事食品安全与质量控制研究。

2015-03-23

S 851.34+7.1

A

0517-6611(2015)13-267-03