食品中金黄色葡萄球菌定量检测方法比较研究

曹建平　韩丹　王健

摘要：[目的] 探求一种适应食品微生物实验室检验要求的快速准确的方法。[方法]比较研究Baird-Parker平板法、MPN法、科玛嘉金黄色葡萄球菌显色培养基法和PetrifilmTM测试片法这4种定量方法对金黄色葡萄球菌的选择性、灵敏度和在食品中的应用。[结果]试验显示，4种方法检测金黄色葡萄球菌选择性良好；MPN法、显色培养基法和纸片法灵敏度比Baird-Parker平板法稍高；4种方法应用在食品检测中，金黄色葡萄球菌检出率无显著差异。因此可选择显色培养基和PetrifilmTM测试纸片法作为日常检验的辅助手段，以提高检测灵敏度、缩短检验周期。[结论] 研究可为食品检测方法的研究及应用积累一定的经验，为今后金黄色葡萄球菌的检测工作提供一定参考。

关键词：金黄色葡萄球菌；定量检测方法；比较研究

中图分类号：S182 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）08-242-02

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）属于葡萄球菌属，是一种重要的病原菌，是典型的革兰氏阳性菌，有较强的抵抗力。金黄色葡萄球菌营养要求不高，且有高度的耐盐性，容易污染肉类、水产品、乳品等食品，在世界各个国家中，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒在细菌性食物中毒中均占较大比例[1-2]，金黄色葡萄球菌引起的食物中毒已成为世界性的公共卫生问题。

目前关于食品中金黄色葡萄球菌的定量检测方法主要有Baird-Parker平板计数法[3]、MPN计数法[3]、测试纸片法[4]、显色培养基计数法等。其中Baird-Parker平板计数法和MPN计数法为国标法的第二法和第三法，但两者都存在耗时、工作量大的缺陷，很难适应现在快速检验要求；测试纸片法、显色培养基计数法检测周期短、工作量小，已经得到了很多机构的认可。笔者比较研究了这4种定量方法对金黄色葡萄球菌的选择性、灵敏度和在食品中的应用，以Baird-Parker平板计数法为基准，将结果进行比较分析研究，旨在探求一种适应食品微生物实验室检验要求的快速准确的方法，为食品检测方法的研究及应用积累一定的经验，为今后金黄色葡萄球菌的检测工作提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂及培养基。

平板计数琼脂、营养肉汤、BHI肉汤、Baird-Parker琼脂基础、卵黄亚碲酸钾增菌剂、冻干血浆，青岛海博生物技术有限公司；革兰氏染色液，北京陆桥；科玛嘉金黄色葡萄球菌显色培养基，法国科玛嘉公司；PetrifilmTM6491金黄色葡萄球菌测试片、PetrifilmTM6493金黄色葡萄球菌确认反应片，美国3M公司。

1.1.2 试验菌株。

金黄色葡萄球菌（ATCC25923）、大肠埃希氏菌（ATCC25922）、表皮葡萄球菌（ATCC29069），宁波市鄞州区食品检测中心提供。

1.1.3 样品。

采集宁波市农贸市场及超市的食品50份， 其中生肉类10份、熟肉制品10份、生牛奶10份、豆制品10份、糕点10份。

1.2 试验方法

1.2.1 金黄色葡萄球菌的检验。Baird-Parker平板计数法：按GB 4789.10-2010第二法检验。

MPN法：按GB 4789.10-2010第三法检验。

科玛嘉金黄色葡萄球菌显色培养基平板法：每个稀释度分别吸取1 ml样品匀液以0.3、0.3、0.4 ml接种量分别加入3块显色培养基平板上，然后用无菌L棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘，按说明书判读。

PetrifilmTM测试片计数法：取1 ml稀释好的菌液接入测试片，静置测试片1 min，（36±1）℃培养24 h，按说明书判读，有可疑菌落时，用确认反应片做补充试验。

1.2.2 选择性鉴定试验。

将3株试验菌株分别划线接种于Baird-Parker平板和显色培养基平板；MPN法的鉴定同Baird-Parker平板；以生理盐水作10倍系列稀释，取1 ml接种PetrifilmTM测试片（使菌液终浓度在100～1 000 CFU/ml）；36 ℃培养24～48 h，观察各菌株的典型生长情况，并进行特异性比较。

1.2.3 灵敏度试验。

在4种培养基上加入不同菌浓度的金黄色葡萄球菌菌悬液，每个测试作2个平行，按“1.2.1”方法培养，判读，计数，同时以平板计数琼脂倾注法计算菌浓度作对照，评价4种试验方法的检测灵敏度。

1.2.4 食品中检测应用 。

无菌生理盐水作10倍系列稀释同一样品后，选择适当的稀释度分别按“1.2.1”方法检测，结果用SPSS 18.0软件以χ2检验分析。

2 结果与分析

2.1 选择性试验比较 3株试验菌株中，金葡菌在4种培养基中生长良好（MPN法最终也是用BP平板筛选），特征菌落明显，表皮葡萄球菌在4种培养基中虽然有生长，但无典型特征性菌落，大肠埃希氏菌在4种培养基中均不生长，结果见表1。分析结果得出，各种培养基对金葡菌的选择性都良好，符合计数培养基的选择性要求。

2.2 灵敏性试验 用4种检测方法分别对金葡菌进行计数，MPN法、显色培养基法和PetrifilmTM测试片法灵敏度比Baird-Parker平板法稍高一个数量级，但均能满足计数要求，结果见表2。

2.3 食品中金黄色葡萄球菌检出结果分析 50批样品中金葡菌的检出率如表3所示。显色培养基法、MPN法和纸片法检出率分别为24%、22%和22%，结果差不多，检出率比Baird-Parker平板法的稍高。但通过SPSS统计分析表明，MPN法、显色培养基法、纸片法和Baird-Parker平板法无显著差异（χ2=2.64<χ20.05，12，P>0.05）。

2.4 金黄色葡萄球菌各种定量检验方法比较 对检测金黄色葡萄球菌几种方法指标的评价见表4。Baird-Parker法需涂布后观察然后挑去可疑菌落转接BHI肉汤后，再做血浆凝固酶进行证实试验，耗时3～4 d。MPN法更是需要对样品先进行增菌，然后再接种观察培养验证，耗时更长，步骤更是繁琐、量大。显色培养基、测试片法是基于微生物自身代谢产生的酶与相应显色底物反应显色的原理，显色培养基临用前加热煮沸溶解即可使用，接种后24 h观察结果，无需证实试验；纸片法只需培养后对可疑菌落加确认反应片验证即可对最终结果进行判定。在实际检验运用中，显色培养基、测试片法较传统培养基有工作量少、使用简便、灵敏度高、周期短的优点，但显色培养基和测试片成本要比Baird-Parker法和MPN法高。

3 结论与讨论

金黄色葡萄球菌其菌落有典型的金黄色特征，是食源性致病菌的一种，但在日常检测过程中，常会造成金黄色色素不典型的现象，若单纯使用传统Baird-Parker平板和血平板，容易造成误判，张琳从BP平板上随机挑取典型菌落做血浆凝固酶验证试验，结果检出率为66%[5]，这一结果与一文献中报道的相符合[6]，这漏检往往会导致食品安全事故。Baird-Parker法涂布时受人员熟练程度等人为因素影响，菌落有时分布不均匀而难以计数。当样品中金葡菌浓度低时，Barid-Parker法和MPN法结果没有显著差异，但Barid-Parker法更接近理论值，一般不选择MPN法[7]。科玛嘉金黄色葡萄球菌显色培养基可直观上对几种葡萄球菌进行有效区分，避免了漏检和误判，节省了检测时间。PetrifilmTM测试片，操作步骤标准化，人为误差较小，携带方便尤其适合现场取样检验。但测试片法计数时，黑色或蓝绿色的可疑菌落较多，而紫红色菌落相对较少，加确认片反应后，也只有少量菌落有粉红色晕圈。因此使用测试片法计数时，如杂菌过多，则将会影响结果，建议同时多做几个稀释度。

通过比较，虽然显色培养基法及测试片法成本较高，但金黄色葡萄球菌的检出率与传统国标法即Barid-Parker平板法和MPN法相比无显著差异，却极大地缩短了检测时间，且操作简便。在实际检测工作中，可将选择显色培养基和PetrifilmTM测试纸片法作为日常检验的辅助手段，在实验室检验中推广应用。

参考文献

[1] 李自然，施春雷，宋明辉，等.上海市食源性金黄色葡萄球菌分布状况[J].食品科学，2013，34（1）：268-271.

[2] 陈广全，张惠媛，曾静.食品安全检测培训教材 微生物检验[M].北京：中国标准出版社，2010：351-352.

[3] 中华人民共和国卫生部.GB 4789.10-2010.食品安全国家标准 食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验 [S].北京：中国标准出版社，2010

[4] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.SN/T 1895-2007 食品中金黄色葡萄球菌的快速计数法PetrifilmTM 测试片法[S].北京：中国标准出版社，2007.

[5] 张琳.食品中金黄色葡萄球菌检测方法的比较研究[J].食品工业科技，2006，27（6）：166-169.

[6] SCHOELLER N P，LNGHAM S C.Comparison of the Baird-Parker agar and 3MTM Petrifilm rapid S.aureus count plate methods for detection and enumeration of Staphylococcus aureus[J]. Food Microbiol， 2001，18：581-587.

[7] 陆岚，张勇，张勇琪，等.金黄色葡萄球菌定量检验方法研究[J].大家健康，2011，5（11）：39-40.