UPLC-MS/MS同时检测广式腊味制品中5种生物胺的方法研究

梁 波 (广东省中山市质量计量监督检测所，广东中山 528403)

生物胺广泛存在于各种动植物组织中，在人和动物活性细胞中发挥着重要生理作用，但当摄入过量时，会引起头痛、呼吸困难、心悸等过敏反应和症状。因此在动物源性食品生产过程中，必须减少其中生物胺的含量才能生产出更为安全的食品。广式腊味制品以其独特的风味，深受粤港澳地区广大群众欢迎，但人们更希望在享受美味的同时能够吃到放心肉，而生物胺的含量便作为肉制品原料新鲜度的指标越来越受到食品安全工作者的关注。由于生物胺分子中缺少发色基团，无紫外吸收、也无荧光及电化学活性，因此传统的比色、滴定等方法在检测生物胺方面存在一定的困难。目前国家标准推荐方法是采用酶生物传感器法、电泳法、薄层色谱法紫外分光光度计或者高效液相色谱法(HPLC)等，其中GB/T5009．208采用HPLC测定食品中生物胺含量，但该方法存在需要进行柱前或柱后衍生，反应条件苛刻，前处理耗时较长以及阳性样品无法确证等不足。近年来，超高效液相色谱－串联质谱(UPLC-MS/MS)仪由于效率高、灵敏度高、选择性强等优点越来越多地被用于食品污染物和营养成分的检测。基于此，笔者将采用超高效液相色谱－串联质谱研究能测定广式腊味中多种生物胺含量的新方法。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 原料与试剂。供试样品为市场上某品牌腊鱼。主要试剂:三氯乙酸，1%;甲酸，色谱纯，德国Merck公司;甲醇、氨水，色谱纯;组胺、尸胺、色胺、腐胺、2-苯乙胺标准物质、1，7庚二胺内标物，德国Dr．Ehrenstorfer Gmbhgong公司;试验用水均为超纯水。

主要仪器:超高效液相色谱－串联三重四级杆质谱仪，美国 WATERS公司(UPLC-XevoTQ);分析天平，感量为0．000 1 g和 0．01 g，赛多利斯;冷冻离心机，德国(Sigma3-18k);具塞塑料离心管:50 ml;色谱柱，ACQUITY UPLCr HSS C181．7或同等性能色谱柱;中性氧化铝固相萃取小柱，菲罗门公司;氮吹仪，上海安谱科学仪器有限公司。

1．2 仪器工作条件 色谱－质谱条件:流速0．4 ml/min，柱温40℃，样品温度15℃，流动相为A(0．01%甲酸水+0．05氨水水溶液)－B(0．1%甲酸甲醇)，梯度洗脱程序为0～0．75 min 60%A ～ 40%B，0．75 ～ 1．00 min 60%A ～ 40%B，1．00 ～1．25 min 30%A ～70%B，1．90 ～3．80 min 90%A ～10%B，3．80 ～5．00 min 90%A ～10%B。离子源:电喷雾离子化源(ESI);扫描模式:正离子扫描;离子源温度:150℃;脱溶剂温度:550℃;脱溶剂气(N2)，流量:1 000 L/H;毛细管电压:0．5 kV。

1．3 试验方法

1．3．1 样品的提取。准确称取样品1～2 g至50 ml离心管中，加入浓度为1 000 μg/L 1，7-庚二胺(内标)100 μl，涡旋混匀，加入5 ml 0．01%甲酸水+0．05%氨水甲醇溶液涡旋振荡提取，于10 000 r/min离心机离心3 min，取上清液，重复提取2次，合并提取清液，常温下氮气吹干，用5 ml 1%甲酸甲醇溶液溶解，溶解液备用。

1．3．2 样品净化。用2 ml甲醇、2 ml去离子水活化中性氧化铝固相萃取小柱，将上述溶解液加入小柱内，控制流速，收集流出液，常温下氮气吹干，用流动相定容至1 ml，然后过0．22 μm滤膜进行色谱分析。

2 结果与分析

2．1 样品的提取与净化 为了更充分地提取待测物质，所以该方法选择用少量流动相多次重复提取的方法以达到最佳提取效果。同时在待测样品中加入内标物，减少前处理过程中造成待测物质的损失所导致结果偏低的误差。在样品净化方面选用了中性氧化铝固相萃取小柱，除去一些油脂类的杂质等。

2．2 色谱条件的选择 流动相的组成和比例既影响物质的分离又影响灵敏度。由于待测的化合物在质谱方面正负两种离子模式下哪种响应较强未知，经研究流动相选择发现0．01%甲酸水+0．05%氨水溶液和甲醇最理想，采用梯度洗脱让化合物分离更好、峰型更好。

图1 5种生物胺标准溶液UPLC-M S/MS

2．3 质谱条件的优化 将标准混合液直接引入质谱进行调谐，分别在正负两种离子模式下进行母离子全扫描。结果表明，待测化合物在正离子扫描模式下响应值较高，因此以正离子模式进行二级质谱扫描获得子离子质谱信息，选择两个丰度较高而且稳定的子离子作为定性离子和定量离子，得到每种物质的最佳质谱参数(图1)。

但由于流动相选择了0．01%甲酸水+0．05%氨水溶液和甲醇溶液，将毛细管电压逐步调低(常用为3．0 kV)，发现待测化合物得到的响应值都较常用的3．0 kV高，因此最终将毛细管电压调低到0．5 kV，得到很好的效果，见表1。

2．4 线性范围与检出限 配制不同浓度混合标准工作溶液注入超高效液相色谱－串联质谱，记录色谱峰面积，以质量浓度Y为纵坐标，色谱峰面积X为横坐标作校正曲线，得到线性回归方程，由于日常产品标准中组胺的标准判定值较高，而且检测仪器是液质联用，因此笔者选用5种化合物浓度在200．0～600．0 μg/L范围。在此范围内其线性关系良好，相关系数均大于0．999，线性方程和检出限见表2。

表1 MRM监测模式下质谱优化条件

表2 5种生物胺标准曲线、相关系数和检出限

2．5 方法回收率与精密度 在不含待测化合物的腊鱼样品中添加3个不同浓度水平的混合标准液，按“2．1”或“2．2”前处理后进行试验，每个试验重复6次，见表3。由表3可见，供试腊鱼中5种生物胺的加标回收率在86．6% ～91．6%。

2．6 实际样品测定 利用该研究分析方法对50个腊肠样品、10个腊鱼样品、10个速冻水产品进行测定，其中8个样品检出生物胺，检出含量为 0．5～6．0 mg/kg，均少于 10 mg/kg。

表3 5种生物胺标准物质在样品中的加标回收率

3 结论

从超高效液相色谱－串联质谱检测5种生物胺的结果可见，超高效液相色谱－串联质谱同时测定广式腊味制品中组胺、尸胺、色胺、腐胺、2-苯乙胺的新方法灵敏度高，测定结果准确可靠，方法精密度高，尤其比液相色谱法更节省时间。由于前处理条件比较简单，再通过用内标法定量，既能排除假阳性干扰，又能减少系统误差且定量准确，使用此方法检测广式腊味中组胺、尸胺、色胺、腐胺、2-苯乙胺能大大提高日常检测工作效率，建议在检测机构和相关企业中应用和推广。

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