低胰蛋白酶抑制剂全豆豆浆的研制

霍建冶，王建光，吴超义，钱 和，成玉梁(江南大学食品学院，江苏无锡214122)

不排豆渣的全豆豆浆是利用超微粉碎技术实现大豆营养全利用的豆浆，口感细腻，富含大豆蛋白、膳食纤维等营养物质。大豆蛋白是一种理想的植物蛋白，氨基酸种类齐全，其中人体所必需的8种氨基酸的含量基本上与联合国卫生组织所建议的相近［1］。但是，大豆蛋白中有抗营养因子胰蛋白酶抑制剂［2］。胰蛋白酶抑制剂对人体的危害主要表现在抑制人体胰蛋白酶活性，食用未完全除去胰蛋白酶抑制剂的豆制品时，不仅会抑制人体对蛋白质的消化吸收，还会引起胰腺肿大等中毒症状［3］。研究表明，当大豆中的胰蛋白酶抑制剂含量降低90%以上时才被认为可放心食用。主要的去除方法包括物理处理法、化学处理法和生物处理法等。其中物理法钝化是研究最广泛的，而热失活是常用的钝化大豆胰蛋白酶抑制剂的方法。但过度加热将导致大豆中某些氨基酸，尤其是赖氨酸、精氨酸和色氨酸等碱性氨基酸利用率下降［4］。化学处理方法主要有尿素处理、乙醇处理等。操作方便，但有化学物质残留，应用较少。生物学方法主要有酶制剂处理法、微生物发酵法、发芽处理法等。大豆胰蛋白酶抑制剂可以被蛋白酶水解，改变活性中心而失活［5］。应用酶法消除大豆蛋白中的胰蛋白酶抑制剂具有效率高，保护营养成分，安全无残留等优点。笔者创新性地在打浆阶段加入中性蛋白酶，研究其对胰蛋白酶抑制剂的钝化效果，以期为工业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂。东北大豆;中性蛋白酶(活力大于1 600 AZO/g);牛胰蛋白酶;氢氧化钠;甲醛溶液;苯甲酰-DL-精氨酸-p-硝基酰替苯胺盐酸盐(BAPA);Tris;氯化钙;盐酸溶液;冰醋酸;β-环糊精。

1.1.2 主要设备。打浆机，胶体磨，恒温磁力搅拌器，高压均质机，激光粒度分析仪，分光光度计，水浴锅。

1.2 试验方法

1.2.1 全豆豆浆制备方法。大豆除残、除杂、清洗后，按1∶3的豆水质量比于4℃下浸泡18 h。将浸泡完全的大豆沥干，置于沸腾的0.5%(W/V)的NaHCO3溶液中进行热烫处理6 min。

将热烫后的湿豆冲洗至中性后和一定温度去离子水按一定比例混合，加入一定量的中性蛋白酶，打浆机粗粉碎2 min后静置让蛋白酶充分反应。酶解片刻后迅速将豆浆加热至80℃保温10 min灭酶。

灭酶后的豆浆使用胶体磨粉碎1 min，然后使用高压均质机进一步细化豆浆，最终得到口感细腻的全豆豆浆。

1.2.2 胰蛋白酶抑制剂含量的测定。将样品稀释，使其产生40%～60%的抑制百分率。分别加溶液于下面4个10 ml具塞玻璃离心管中:(a)标准空白。5 ml BAPA溶液，3 ml去离子水，1 ml 5.3 mol/L醋酸。(b)标准溶液。5 ml BAPA溶液，3 ml去离子水。(c)样品空白。5 ml BAPA溶液，1 ml样品稀释液，2 ml去离子水，1 ml 5.3 mol/L醋酸。(d)样品溶液。5 ml BAPA溶液，1 ml样品稀释液，2 ml去离子水。将各离心管充分混匀后置于37℃恒温水浴锅中温育10 min。然后各离心管均加入1 ml胰蛋白酶工作液，混匀，继续温育10 min±5 s后于(b)管和(d)管中分别加入1 ml 5.3 mol/L醋酸终止反应。充分混合上述溶液，用分光光度计在410 nm用10 mm比色皿测定溶液吸光度(用标准空白调零)。该溶液能够保持稳定至少2 h［6］。

结果计算:

①胰蛋白酶抑制百分率。公式如下:

式中，I为胰蛋白酶抑制百分率;Ar为标准溶液的吸光度;As为样品溶液的吸光度;Abs为样品空白吸光度。

②胰蛋白酶抑制剂活性。只有样品提取液胰蛋白酶抑制百分率在40%～60%范围内时，样品溶液吸光度可用于胰蛋白酶抑制剂活性计算。计算胰蛋白酶抑制剂活性，用每克样品抑制的胰蛋白酶毫克数表示，结果精确至0.1 mg/g。

式中，TIA为胰蛋白酶抑制剂活性(mg/g);AI=Ar－(As－Abs)为吸光度变化值;V是样品提取液体积(ml);m是测试样品的质量(g);0.019是1 μg纯牛胰蛋白酶在410 nm波长的吸光度;D是样品的稀释倍数。

③胰蛋白酶抑制剂钝化率的计算。计算公式:

式中，TIA0为根据未处理大豆折算的豆浆中胰蛋白酶抑制剂活性，TIA1为酶解后豆浆中胰蛋白酶抑制剂。

1.2.3 豆浆水解度的测定。取水解灭酶后5.0 ml酶解液，置于200 ml烧杯中，加入60 ml无CO2水，开动磁力搅拌器，加少量碱液调节pH为8.20，再加入10 ml中性甲醛溶液，用0.5 mol/L NaOH标准溶液调节体系pH至9.20，记录消耗NaOH标准溶液体积为V(ml)。同时取未酶解相同浓度蛋白质溶液5.0 ml，按上述方法作空白试验，记录消耗NaOH标准溶液体积为V0(ml)。

式中，C为 NaOH标准溶液浓度(mol/L);V为酶解液消耗NaOH标准溶液体积(ml);V0为空白液消耗NaOH标准溶液体积(ml);0.014为氮毫克当量;N为底物样品总氮含量(g)。

1.2.4 酶法钝化胰蛋白酶抑制剂的单因素试验。分别考察打浆豆水比:1∶5～1∶9、打浆温度:30～70℃、蛋白酶添加量:0～20 μl/g、酶解时间:0～30 min对豆浆水解度和胰蛋白酶抑制剂钝化率的影响。

1.2.5 酶法钝化胰蛋白酶抑制剂条件的正交试验优化。采用正交试验对酶解条件进行优化，根据单因素试验结果，研究豆水比、打浆温度、加酶量和酶解时间4个因素对试验结果的影响。通过单因素试验确定4个因素的取值水平范围，以胰蛋白酶抑制剂钝化率为指标，以确定最佳水解条件组合。正交试验组合见表1。

1.2.6 豆浆脱苦效果的感官评定。向酶解完成后的豆浆中加入不同质量的β-环糊精，80℃下保温10 min，经过超微粉碎后由10名感官评定员进行评定。表2为感官评定标准。

2 结果与分级

2.1 打浆豆水比对豆浆水解度和胰蛋白酶抑制剂钝化率的影响 打浆时的豆水比影响着底物浓度，豆水比太低，底物浓度低，酶与底物接触的几率小，水解度低。豆水比过高，底物浓度高，蛋白质分子会通过疏水作用和二硫键作用，形成网状聚合体，降低酶解效率［7］。

表1 正交试验因素水平设计

表2 感官评分标准

豆水比分别为 1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9，加酶量为 6 μl/g蛋白，打浆温度50℃，酶解15 min，结果如图1、图2所示，胰蛋白酶抑制剂(TI)的钝化率与水解度呈正相关趋势。当豆水比1∶7时，豆浆水解度和TI钝化率最高。

图1 豆水比对豆浆水解度的影响

图2 豆水比对胰蛋白酶抑制剂钝化率的影响

2.2 打浆温度对豆浆水解度和胰蛋白酶抑制剂钝化率的影响 保持豆水比1∶7，加酶量为6 μl/g蛋白酶解时间15 min时，研究不同的打浆温度对水解度和TI钝化率的影响。如图3、图4所示，打浆温度从30℃提高到50℃，酶解反应速度相应提高，但是打浆温度超过50℃后，水解度和胰蛋白酶抑制剂钝化率降低。

图3 打浆温度对豆浆水解度的影响

打浆过程为升温过程，打浆结束后豆浆的终温会影响蛋白酶分子稳定性，这是因为蛋白酶分子的肽键具有特定的空间结构，如果反应温度过高，会引起次级键解离，从而使蛋白酶丧失或部分丧失催化活性;但是若反应温度过低，则会大大降低体系内分子运动的激烈程度，从而降低蛋白酶与底物的碰撞机率［8］。

图4 打浆温度对胰蛋白酶抑制剂钝化率的影响

2.3 蛋白酶添加量对豆浆水解度和胰蛋白酶抑制剂钝化率的影响 保持豆水比1∶7，打浆温度50℃，蛋白酶解时间15 min时，考察中性蛋白酶添加量对水解度和胰蛋白酶抑制剂钝化率的影响，结果如图5、图6所示。当添加量大于14 μl/g蛋白时，水解度和胰蛋白酶抑制剂钝化率变化平缓。

随着中性蛋白酶用量增加，酶的催化位点与蛋白分子相应位点接触几率增多，水解度升高。当这些位点快全部断裂时，即使继续加入蛋白酶，肽键都难以再断裂。

图5 中性蛋白酶添加量对豆浆水解度的影响

2.4 酶解时间对豆浆水解度和胰蛋白酶抑制剂钝化率的影响 保持豆水比1∶7，打浆温度50℃，添加6 μl/g蛋白的中性蛋白酶，考察水解时间对豆浆水解度和胰蛋白酶抑制剂钝化率变化的影响，结果如图7、图8所示。15 min内水解度和胰蛋白酶抑制剂迅速上升，20 min后水解度和胰蛋白酶抑制剂钝化率的变化趋势平缓。

图6 中性蛋白酶添加量对胰蛋白酶抑制剂钝化率的影响

图7 酶解时间对豆浆水解度的影响

图8 酶解时间对胰蛋白酶抑制剂钝化率的影响

2.5 胰蛋白酶抑制剂钝化条件的优化 该试验采用L9(34)的正交表设计，正交试验结果和极差分析见表2。用SPSS软件对结果进行分析处理，建立钝化率与因素的数学模型，以胰蛋白酶抑制剂钝化率为指标，通过对模型分析获得最佳工艺条件。由表2可知，影响钝化率的主次关系为:豆水比＞水解温度＞酶用量＞酶解时间。最佳组合为豆水比1∶7、水解温度50℃、酶用量16 μl/g、酶解时间20 min，在此基础上进行验证试验，胰蛋白酶抑制剂钝化率为90.5%，符合要求。

2.6 酶解后豆浆的脱苦 结果如表3所示，当添加3.0%的β-环糊精时，感官评分最高。当蛋白质水解时，随着肽链解离，可呈现苦味的疏水性氨基酸残基或其形成小肽游离出来，产生苦味［9］。β-环状糊精是由7个葡萄糖分子连接成的环状结构化合物，主体构型像个中间有空洞，两端不封闭的筒［10］。圆筒上部的广口排列着12个C2，C3的羟基，底部狭窄处有6个C6羟基。因而从整体上看环糊精是亲水的，但是由于环的内侧被C-H所覆盖，与外侧相比有较强的疏水性。当溶液中同时存在亲水和疏水性物质时，疏水物质则被环内疏水基团吸附而形成包含化合物。对于疏水性多肽来说，该机理的实际效果则是对苦味起到“包埋”作用［11］。另外，β-环状糊精本身也带有淡淡的甜味［12］。

表2 正交结果分析

表3 β-环糊精用量对豆浆感官评定的影响

3 结论

该研究给出了一种利用湿法超微粉碎技术，并在打浆时添加中性蛋白酶来生产低胰蛋白酶抑制剂的全豆豆浆的方法，为其工业化大生产提供了参考。试验结果表明，豆浆的胰蛋白酶抑制剂钝化率和水解度呈正相关趋势，苦味也会随着水解度的提高而提高。豆水比1∶7，打浆温度50℃，加入16 μl/g蛋白质的中性蛋白酶，酶解20 min后灭活，可钝化90%以上的胰蛋白酶抑制剂。添加3.0%的β-环糊精可以完全掩蔽酶解后豆浆的苦味。

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