苹果多酚对高糖高脂膳食加STZ诱导的糖尿病小鼠血脂·血糖水平和PPARγ基因表达的影响

李新明，高忠东，李 群，田志芳，郭志利(山西省农业科学院加工所，山西太原030031)

糖尿病的主要特点表现为胰岛素绝对或相对不足引起的血糖水平升高，同时常伴有脂肪代谢紊乱进而出现高脂血症［1-2］。目前，已知核转录因子过氧化物酶体增生物激活受体(Peroxisome proliferator activated receptor，PPAR)是一种激素激活受体和转录因子。迄今，3种PPAR亚型相继被克隆，并且分别被命名为PPARα、PPARγ和PPARδ。PPAR是调节脂质代谢、脂肪生成、胰岛素敏感性、炎症反应、细胞生长和分化的重要因子［3］，并可能在糖尿病性肾病、高血压病和动脉粥样硬化发生、发展中扮演重要角色［4-5］。近年来研究发现，部分天然产物活性成分有作为PPARγ激动剂、改善胰岛素抵抗的潜能。

苹果多酚是苹果中所含多元酚类物质的总称，包含绿原酸、儿茶素、表儿茶素、根皮苷、根皮素、槲皮素、原花青素等活性物质［6］。大量的试验表明，苹果多酚具有广泛的生物药理活性，包括抗肿瘤、抗氧化、降脂、抗动脉硬化、抗紫外线、预防糖尿病等功效［7-9］，已被广泛用于保健食品、医药和化妆品中。笔者检测了苹果多酚对小剂量链脲佐菌素加高脂高糖饲料诱导的糖尿病模型小鼠血清丙二醛、血脂、血糖、胰岛素水平以及肝、肾、脂肪组织PPARγ基因表达的影响，以便探讨苹果多酚在糖尿病防治方面的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 苹果多酚由山西省农业科学院加工所食品营养功能分析试验室提取、制备;链脉佐菌素临用前用柠檬酸缓冲液配制。

1.2 苹果多酚对α-葡萄糖苷酶活性抑制试验 α-葡萄糖苷酶水解底物PNPG能生成对硝基苯酚(PNP)，在405 nm处能检测到PNP的吸收峰。将1 ml不同浓度的苹果多酚溶液加入到2 ml磷酸盐缓冲溶液(pH 6.8)中，再加入0.1 ml 1 U/ml α-葡萄糖苷酶混匀，在37℃下水浴10 min。接着，加入0.25 ml 10 mmol/L PNPG来起始反应，反应进行20 min后，加入2 ml 0.1 mol/L碳酸钠溶液终止反应，在400 nm处测定吸光度(A1)，用缓冲液代替苹果多酚测定其吸光度值(A0)，用缓冲液代替酶液测定其吸光值(A2)［10］。试验3次重复。

抑制率(%)=［1-(A1-A2)/A0］×100%

1.3 苹果多酚对α-淀粉酶活性抑制试验 100 μl不同浓度苹果多酚溶液与100 μl淀粉酶溶液(5 mg/L)在室温下预混合10 min后，加入可溶性淀粉溶液(200 μl 0.5%)来起动反应，反应中使用磷酸盐缓冲液缓冲液(1 ml 25 mmol/L，pH 6.8)。反应混合液于37℃反应5 min后，加入1 ml DNS试剂中止反应，反应液置沸水浴中5 min后于冰水浴中迅速冷却，加3 ml蒸馏水稀释后测定540 nm吸收值，同时设样品对照［11］。重复3 次试验。

1.4 高糖高脂饲料的配制 配方为10%猪油、20%蔗糖、1%胆酸盐、2.5%胆固醇、66.5%常规饲料。

1.5 小鼠糖尿病模型的建立 将雄性昆明种小鼠60只饲养7 d，检测空腹血糖作为该批次动物的基础血糖值。动物随机分组，以12只作为正常对照组，普通饮食饲喂;另48只小鼠给予高脂高糖饮食28 d后，禁食不禁水16 h，腹腔注射STZ(50 mg/kg b.w.)。14 d 后，检测小鼠空腹血糖、血脂、胰岛素及胰岛素抵抗指数。选择血糖值在10.0～25.0 mmol/L，同时伴脂代谢紊乱的模型小鼠用于正式试验。将48只小鼠随机分为模型组以及苹果多酚高、中、低(10、7、4 mg/kg b.w.)剂量组，每组12只。连续灌胃60 d。60 d后，禁食12 h，眼球采血，分离血清。取肝脏、肾脏、脂肪组织，制成组织匀浆，备用。

1.6 生化指标测定 使用试剂盒，测定血清中MDA、SOD水平。所有的操作均按试剂盒说明进行。小鼠空腹血糖、血脂、胰岛素、TG、TC、LDL-c、HDL-c用全自动生化仪测定。采用葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖(FBG);采用酶联免疫测定法测定空腹血清胰岛素(FINS)，计算胰岛素抵抗指数。

HOMA-IR=(FBG × FINS)/22.50

1.7 实时定量PCR检测PPARγ基因的表达 引物设计:PPARγ 上游 5＇-5＇-CATGGCCATTGAGTGCCGAGT-3＇，下游 5＇-ACATCCCCACAGCAAGGCAC-3＇;GAPDH 上 游 5＇-TGACCTCAACTACATGGTCTACA-3＇，下游5＇-CTTCCCATTCTCGGCCTTG-3＇。使用Trizol试剂从组织中提取总RNA，通过寡脱氧核苷酸和MMLV逆转录酶合成cDNA，采用Tag DNA多聚酶PCR反应扩增cDNA产物，应用ABIPRISM 7000序列检测系统测定mRNA拷贝和循环数的线型关系，设定标准曲线。将正常对照组mRNA的表达量设为1，计算各组mRNA的相对表达量。

1.8 统计学方法 使用SPSS12.0软件处理分析数据，试验结果用±SD)表示，组间数据差异进行比较，当P＜0.05时表明差异有统计学意义。

2 结果与分析

由图1可知，苹果多酚能显著抑制α-葡萄糖苷酶活力。当苹果多酚浓度从0增加到1.5 mg/L时，酶活力抑制率从16.4%增加到85.2%，之后随着苹果多酚浓度的继续增加，酶活力抑制率不再显著地增加。苹果多酚对α-葡萄糖苷酶活力的 IC50约为0.9 mg/L。

由图2可知，苹果多酚能显著抑制α-淀粉酶活力。当苹果多酚浓度从0增加到1 g/L时，酶活力抑制率从0增加到52.3%，随着苹果多酚浓度的继续增加，酶活力抑制率缓慢地增加。苹果多酚对α-淀粉酶酶活力的IC50约为1 g/L。

由表1可知，与对照组相比，模型组小鼠血清MDA水平明显增加，经苹果多酚干预处理后，血清MDA水平明显降低;与对照组相比，模型组小鼠血清 SOD水平明显降低，经苹果多酚干预处理后，血清SOD水平随苹果多酚的剂量增加而明显增加。

表1 糖尿病小鼠血清MDA和SOD活力

由表2可知，模型组小鼠血清TG、TC和LDL-c水平均明显增加，HDL-c降低;经苹果多酚干预处理后，血清TG、TC和LDL-C水平均明显下降，而HDL-c明显增加。这一降脂效果随苹果多酚的剂量增加而增加，呈明显的量效关系。

表2 苹果多酚对糖尿病小鼠血清TC、TG、LDL-c和HDL-c水平的影响 mmol/L

由表3可知，与正常对照组相比，模型对照组FBG、FINS、IRI均显著升高;与模型对照组相比，苹果多酚干预组FBG、FINS、IRI水平随剂量的增加而降低。

由表4可知，各组小鼠的肝、肾、脂肪组织均有PPARγ mRNA的表达。与对照组相比，模型组小鼠肝、肾、脂肪组织PPARγ mRNA的表达均显著减少;苹果多酚干预后，各药物处理组小鼠肝、肾、脂肪组织中PPARγ mRNA表达较模型组显著增加。

表3 苹果多酚对糖尿病小鼠血清FBG、FINS、IRI水平的影响

3 结论与讨论

研究表明，高糖高脂饮食诱发出高胰岛素血症和胰岛素抵抗，再通过注射亚致病剂量STZ破坏胰腺功能，导致胰腺代偿性分泌胰岛素的功能障碍，最后诱发出高血糖症。这一模型制备过程模拟了临床大部分2型糖尿病的发病过程［12］。因此，研究中通过高糖高脂饮食结合亚致病剂量链脲佐菌素腹腔注射的方法制备2型糖尿病模型。

表4 苹果多酚对糖尿病小鼠肝、肾、脂肪组织中PPARγ mRNA表达水平的影响

过去的研究证明，糖尿病与自由基损害密切相关［13］。作为机体的正常代谢产物，在平衡状态下自由基在抗菌、消炎和抑制肿瘤等方面具有重要作用和意义。一旦平衡被打破，自由基便会产生强大的伤害作用，造成生物膜的脂质过氧化损伤，引起酶、氨基酸、蛋白质的氧化破坏，对内脏器官、免疫系统的形态功能产生影响，引起机体疾病［14］。苹果多酚具有很强的抗氧化、清除自由基的功效［15］。目前的研究结果表明，高糖高脂饮食结合STZ腹腔注射，试验小鼠血糖值维持在10.0～25.0 mmol/L之间，同时伴有脂代谢紊乱，表明小鼠糖尿病模型的成功建立。通过测定各组小鼠血清MDA、SOD、TG、TC、LDL-C、HDL-C 水平，评估了苹果多酚改善糖尿病的血脂代谢作用。结果显示，苹果多酚可抑制糖尿病小鼠血清中MDA、TC、TG、LDL-C水平的升高，还可明显提高血清中HDL-C、SOD水平，表明苹果多酚能较好地降低氧化应激，改善血脂代谢。

该研究通过血中丙二醛、血脂、血糖、血清胰岛素水平、胰岛素抵抗指数等指标综合评价胰岛素抵抗程度，进而对动物模型和药物治疗效果进行评价。研究表明，小鼠经高糖高脂饲料喂养出现了血脂、血清葡萄糖、胰岛素水平增加、胰岛素抵抗指数上升等现象，表明小鼠出现严重胰岛素抵抗，导致胰岛β细胞代偿性分泌更多胰岛素以维持血糖稳定，最终导致糖耐量受损。经过3个月的苹果多酚灌喂，小鼠血清葡萄糖、胰岛素水平升高，血脂水平、血丙二醛水平和胰岛素抵抗指数均显著下降。这表明苹果多酚能够减轻胰岛素抵抗，改善糖耐量。苹果多酚具有降糖、降脂、改善胰岛素抵抗的功效，可能是通过降低血脂、抗炎、抗氧化，减少组织和血中自由基的形成，从而减少组织的氧化损伤。

PPARs是核激素受体配体激活的转录因子的超家族。其中，PPARγ主要富含于脂肪组织，并且对维持人类胰岛素敏感性，葡萄糖稳态是不可缺少的。当PPARγ基因突变或受其他因素抑制时，可致胰岛素抵抗。此外，PPARγ的配体不仅能增强胰岛素介导的葡萄糖摄取和减轻炎症反应，而且能逆转胰岛素抵抗的主要缺陷，抑制动脉粥硬化的发生，改善内皮功能［16-18］。

研究还表明，与正常对照组相比，各组小鼠肝、肾、脂肪组织中PPARγ mRNA表达量均明显降低。与模型对照组相比，苹果多酚处理各组小鼠肝、肾、脂肪组织中PPARγ mRNA表达量均明显增加，表明苹果多酚能刺激糖尿病小鼠的PPARγ mRNA，使其表达量增加。

总之，苹果多酚能够增强糖尿病小鼠抗氧化功能，清除蓄积的自由基，降低血糖血脂，减轻胰岛素抵抗，改善糖耐量。同时，苹果多酚能够显著增强糖尿病小鼠肝、肾、脂肪组织PPARγ mRNA的表达水平。这可能是苹果多酚改善糖、脂代谢紊乱以及防治糖尿病的作用机制之一。

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