一株聚β-羟基丁酸PHB高产菌株的分离与鉴定

孙新新，郑家珍，王艳青，蔡世玉，陈雷刚(河北大学生命科学院，河北保定071200)

多聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，PHA)是一类广泛存在于微生物细胞内的高分子生物聚酯，一般主要作为碳源和能量的贮藏物质［1］。目前，已发现PHAs至少有150种不同的单体结构。PHA的单体结构也多种多样，其中3-羟基脂肪酸单体包括3-羟基丙酸到3-羟基十六酸的所有成员，还有4-、5-、6-羟基脂肪酸以及含有不饱和键、带有甲基侧链或其他功能基团的3-羟基脂肪酸作为PHA单体的情况［2］。PHAs生产的关键仍然是获得高产、高转化率的微生物菌株［3］，所以从环境中筛选出高产野生菌株是研究工作的热点。目前研究最广泛的是真养产碱杆菌(Alcaligenes eutropbus)。

聚3-羟基丁酸酯(Polyhydroxybutyrate，PHB)是结构最简单的PHA成员。1925年Lemoigne［4］首先发现了聚β-羟基丁酸(PHB)。它具有机械性能非常类似于传统的塑料如聚丙烯或聚乙烯，可挤出，模制，纺成纤维，制成薄膜，并与其他合成的聚合物组成杂聚物［5］。它既可以替代石化塑料制作生产与生活用品，又可以作为医用材料(如心脏瓣膜、人造血管、缝合线、药物缓释与软组织修复)［6］，还是医学组织工程中克隆器官的优良支架材料。笔者以苜蓿含羞草根瘤菌以及根际土壤菌为研究材料，通过革兰氏染色、苏丹黑染色，筛选得到一株菌为227。

1 材料与方法

1.1 菌株

1.1.1 菌种来源。海南、广东、广西、福建自含羞草分离的根瘤菌株，云南禄丰南苜蓿根瘤菌及获得的根瘤内生菌。

1.1.2 培养基与试剂。YMA培养基组成为:KH2PO40.25 g，K2HPO40.25 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，甘露醇10 g，酵母粉0.8 g，琼脂15 ～18 g，pH 6.5 ～7.0。种子培养基组成为:牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，pH 7.0 ～7.2。发酵培养基组成为:葡萄糖30 g，(NH4)2SO43 g，KH2PO4·12H2O 0.61 g，CaCl20.1 g，K2HPO40.3 g，酵母粉 1 g，HBO35 g/L，Na2MoO45 g/L 4 ml，pH 7.0［7］。PHB 标准品由中国农业大学提供。称取3 g苏丹黑B颗粒(西德serva进口分装)，溶到100 ml浓度70%的乙醇中［8］，得苏丹黑B染液。

1.2 方法

1.2.1 活化菌株。将保存的甘油管菌株活化到YMA固体培养基，平板倒置28℃培养1～2 d。

1.2.2 初筛。将菌株活化后重新编号1～2 000，转接到YMA固体培养基的培养皿中，于28℃培养24～48 h后进行革兰氏染色。

1.2.3 复筛。采用苏丹黑染色法将少许细菌热固定于载玻片上后，用3 g/L苏丹黑乙醇溶液染色10～15 min，二甲苯浸泡脱色，再用5 g/L番红水溶液复染，置油镜下观察，PHB颗粒呈蓝黑色，菌体呈红色［8］。

1.2.4 PHA的提取。从试管中取一环菌接种到10 ml发酵管中，培养20 h。发酵培养基的装液量为76 ml，取培养好的种子培养液4 ml，接种量为5%，培养40 h。将发酵液以8 000 r/min离心10 min，蒸馏水洗涤、离心，然后冰冻备用。将离心获得的湿菌体悬浮于45 ml蒸馏水中，加入浓度10%NaClO溶液5 ml、浓度10%SDS 5 ml，使其总体积为50 ml，在35 ℃的恒温水浴中搅拌处理10 min。将处理后的菌液8 000 r/min离心10 min，所获得的沉淀用蒸馏水和丙酮各洗涤1次，烘干，按照10 ml氯仿/0.2 g干菌体的比例加入氯仿，抽提，过滤，滤液蒸发，除去氯仿，以析出PHB。将析出的PHB再分别用丙酮和乙醇洗涤1次，在60～70℃的条件下烘干，得到白色粉末或薄膜状PHB［9］。

1.2.5 筛选菌株的确定。

1.2.5.1 GUTC 法提 DNA。用浓度0.9%生理盐水收集 TY斜面上的菌，每个斜面取1 ml生理盐水冲洗菌体，加入到EP管，12 000 r/min离心2 min，离心洗涤3次，弃上清液，加入600 μl GUTC 缓冲液振荡、摇匀，室温放置 15 min，12 000 r/min 2 min，弃上清液，加入60 μl硅藻土悬液振荡，室温放置 15 min，12 000 r/min 2 min，弃上清液，加入 500 μl GUTC缓冲液振荡、摇匀，室温放置15 min，12 000 r/min 2 min，弃上清液，加入600 μl洗涤缓冲液离心洗涤2次，12 000 r/min 2 min，弃上清，加入600 μl浓度75%乙醇离心洗涤1次，12 000 r/min 2 min，弃上清，在超净工作台干燥沉淀物(硅藻土变白)，加入50 μl TEbuffer 55 ～65 ℃保温5 ～7 min［10］，离心收集上清液至小EP管中。

1.2.5.2 PCR 扩增。反应条件为:94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，56 ℃ 退火 30s，72 ℃ 延伸 90 s，72 ℃8 min，30 个循环。

2 结果与分析

2.1 初筛 初筛的结果见图1。根据菌体中心未染色的面积的大小，筛得200株。

2.2 复筛 利用苏丹黑B染色初筛得到的菌株的结果见图2。菌体外围泛红、内部可见明显的蓝黑色颗粒的菌株可能是产生PHAs的细菌，最后筛得一株PH产生菌。

2.3 菌株227的形态特征 菌株227杆状，两端钝圆，无芽孢，革兰氏阴性菌;细胞大小(0.5 ～0.9)μm ×(1.2 ～3.0)μm;PHB颗粒胞内舍嗜苏丹黑B颗粒，占细胞大部分空间;菌落湿润光滑有光泽、边缘整齐。

2.4 PHB的提取 提取后得到PHB干品，见图3。

2.5 227菌株16s rDNA测序结果及系统发育的分析 测序结果如下:

将该序列已登陆到GeneBank，注册号为HM582870.1。将227菌株的16S rDNA序列在NCBI进行BLAST，所获得的同源序列为根瘤菌的16S rDNA序列，其中相似性最高的为伯克霍尔德属的菌株。227菌株与Burkholderia caribensis，Burkholderia hospita的同源性最高，均为98%，因此确定227菌株属于伯克霍尔德属。

3 结论与讨论

(1)研究中，采用革兰氏染色，进行PHB产生菌的筛选。由于根瘤菌为革兰氏阴性菌，菌体内的酯类会呈现出中心亮点，类似芽孢状，呈不规则状。经苏丹黑B染色，结合显微镜检，选出PHB颗粒较大、生长较旺盛的菌株。该方法大大减少了筛选过程中的工作量，而且取得较好的效果。通过革兰氏染色、苏丹黑染色筛选得到的菌体更加准确。

(2)经初筛、复筛获一高产PHB菌株227，胞内积累大量的PHB颗粒，而且发酵周期短，为今后发酵条件的进一步研究提供保证。

(3)在经过生物学特征研究后，发现菌株227为伯克霍尔德属(Burkholderia)。它是根瘤菌中初次发现的产PHB的菌株。因此，该研究为PHB的产业化提供了菌株资源，具有很好的应用价值。

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