两种絮凝剂对鼠李糖乳杆菌絮凝作用的研究

时间：2024-05-22

谢为天，刘颖，徐春厚(广东海洋大学，广东湛江524088)

壳聚糖是一种天然高分子絮凝剂，无毒副作用，不会造成二次污染。壳聚糖与海藻酸钠交联后形成的缩聚物具有更优良的絮凝和吸附性能，常被用于污水的净化处理，在食品发酵工业上也常用于除去发酵液中的菌体，近来也被用于生产益生菌的研究［1－7］。由于鼠李糖乳杆菌发酵液pH介于3～4，而黄豆浆中大豆蛋白的等电点约为pH 4.5，带正电荷的大豆蛋白质胶体微粒与带负电荷的细菌发生凝聚而沉淀析出［9－12］。笔者以壳聚糖－海藻酸钠和黄豆浆为絮凝剂，研究鼠李糖乳杆菌发酵液的絮凝效果，为该益生菌的液体培养与菌体收集提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 菌种鼠李糖乳杆菌LT22，由广东海洋大学预防兽医学实验室分离、鉴定和保存。

1.2 液体发酵培养基组成为蛋白胨12 g、牛肉浸膏10 g、酵母浸膏4 g、葡萄糖20 g、无水乙酸钠3 g、柠檬酸氢二铵2 g、MgSO4·7H2O 0.6 g、MnSO4·H2O 0.1 g、吐温-80 0.6 g、蒸馏水1 000 ml，pH 6.2 ～6.4，每瓶分装 250 ml，115 ℃灭菌20 min。

1.3 絮凝剂的配制

1.3.1 浓度1.5%壳聚糖溶液。取壳聚糖1.5 g，加浓度1%醋酸溶解100 ml溶解，115℃灭菌20 min。

1.3.2 浓度1.0%海藻酸钠溶液。取海藻酸钠1.0 g，加蒸馏水100 ml，溶解，用0.5 mol/L氢氧化钠溶液调pH至7.6，115℃灭菌20 min。

1.3.3 黄豆浆。取黄豆100 g，置于300 ml蒸馏水中浸泡，6 h后磨制成豆浆，过滤，离心，去除沉淀后补充水至300 ml，115℃灭菌20 min。

1.4 絮凝发酵菌液将鼠李糖乳杆菌接种于液体发酵培养基，37℃培养48 h，连传2代;第2代鼠李糖乳杆菌培养物即为絮凝发酵菌液，备用。

1.5 壳聚糖－海藻酸钠絮凝试验

1.5.1 试验设计。用壳聚糖和海藻酸钠二因子三水平数的一般全因子试验设计(表1)，设3个重复。

1.5.2 絮凝方法。将250 ml絮凝发酵菌液置于烧杯中，在磁力搅拌下缓慢加入海藻酸钠溶液，搅拌均匀后加入壳聚糖溶液，继续搅拌20 min，静置2 h。取絮凝后的发酵菌液液面下2 cm处上清液，用生理盐水进行10倍倍比稀释。取适当稀释度溶液，测定吸光值(A600)，即为絮凝后上清液吸光值。

1.5.3 絮凝效果评价。用沉降率评价壳聚糖和海藻酸钠絮凝剂对鼠李糖乳杆菌的絮凝效果。

沉降率(%)=(1－絮凝后上清液吸光值/混合絮凝发酵菌液吸光值)×100

按试验设计将不同添加量的壳聚糖溶液和海藻酸钠溶液与絮凝发酵菌液混合，搅拌均匀，立即用生理盐水进行10倍倍比稀释，取适当稀释度溶液测定吸光值(A600)。

1.6 黄豆浆絮凝试验

1.6.1 试验设计。采用三因子数和三水平数的一般全因子设计，设3个重复。

1.6.2 絮凝方法。将250 ml絮凝发酵菌液置于三角瓶中，缓慢加入黄豆浆，摇匀，在不同温度的恒温箱中静置一定时间，絮凝后上清液吸光值测定同“1.5.2”。

1.6.3 絮凝效果评价。评价方法同“1.5.3”，只是将其中的壳聚糖和海藻酸钠絮凝剂换成黄豆浆絮凝剂。在不同添加量的黄豆浆与絮凝发酵菌液混合后，立即用酸度计测定pH。

1.7 数据处理用Minitab15软件对试验数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 壳聚糖－海藻酸钠溶液对发酵菌液的絮凝效果壳聚糖与海藻酸钠溶液不同水平组合对鼠李糖乳杆菌絮凝效果见表1和图1。

由表1和图1、2可知，当壳聚糖与海藻酸钠的添加量在6～8 ml时，菌体沉降率处于最大值的深绿色区域;当壳聚糖添加量固定为3 ml时，菌体沉降率在海藻酸钠添加量为3 ml时有最大值(89.45%)，且随着海藻酸钠添加量的增加而明显下降;当壳聚糖添加量固定为6 ml时，菌体沉降率在海藻酸钠添加量为6 ml时有最大值(90.35%)，且随着海藻酸钠添加量的增加或减少均明显下降。

2.2 黄豆浆对发酵菌液的絮凝效果由表2和图3、4可知，影响菌体沉降率最大的因素为絮凝时间和絮凝温度。黄豆浆的添加量对沉降率的影响有随添加量的增加而增大的趋势，但效果不显著;菌体沉降率大于80%的发酵液pH均处于3.65～3.82之间，当发酵液 pH大于3.82时，菌体沉降率均低于70%。可见，发酵液与豆浆混合时的pH对鼠李糖乳杆菌的絮凝效果有明显的影响。

表2 黄豆浆对发酵菌液的絮凝效果

3 讨论

3.1 壳聚糖－海藻酸絮凝剂壳聚糖－海藻酸钠具有凝聚鼠李糖乳杆菌的良好性能。在250 ml鼠李糖乳杆菌发酵液中添加浓度1.5%壳聚糖溶液和浓度1.0%海藻酸钠溶液的体积为6～8 ml时，鼠李糖乳杆菌的絮凝沉淀率达90.35%。鲁诗锋等［13］考察了12种絮凝剂或沉淀剂对1，3-丙二醇发酵液的絮凝处理的效果，发现壳聚糖效果最佳，对发酵液中菌体的去除率达99.97%。张江红等［14］用壳聚糖、海藻酸钠复合絮凝剂处理2，3-丁二醇发酵液去除其中菌体，絮凝率达98%。由此可知，壳聚糖-海藻酸钠絮凝剂具有絮凝细菌的良好效果。但是，用这种复合絮凝剂凝聚沉淀得到菌体难以分散，至于其是否影响益生菌在动物生产上的使用效果有待进一步的研究。

3.2 黄豆浆絮凝剂黄豆浆在最适条件下对鼠李糖乳杆菌的絮凝沉淀率达87.49%，比应用壳聚糖-海藻酸钠复合絮凝剂的菌体沉淀率稍低，但黄豆浆作为絮凝剂收集到的活菌体具有良好的分散性，对益生菌的生产较有利，而且大豆蛋白对活菌体起营养和保护作用。

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