植物根系分泌蛋白研究进展

赵 坤，吕孝敏，胡训霞，张 萍，史春阳，王喜庆，葛才林，王泽港(扬州大学生物科学与技术学院，江苏扬州225009)

根系分泌物是植物与外界信息、物质、能量交流和交换的重要载体物质。早在18、19世纪，Plenk等就发现根系分泌物具有促进生长和抑制邻近植株的作用。到20世纪50年代，研究者发现了根系分泌物与固氮菌之间的互利关系。在20世纪70～90年代，根系分泌物的研究进入一个新的时期。根系分泌物在植物营养、农业生产与环境等领域得到广泛应用，而且根系分泌物与根际微生物间相生、相克关系就成为当时一个重要的研究方向［1］。时至今日，国内外学者在微生物学、土壤学等相关学科的不断发展和研究技术不断改进的基础上，逐步了解和完善不同植物根系分泌物的种类、分泌机制、根系分泌物的检测方法，并且在根系分泌物与根际微生态环境之间相互作用等方面的研究都取得很大的进步。目前，一般把复杂的根系分泌物分为三类:一是具有较强的黏性、吸附性和润湿作用的大分子的有机分泌物，如多糖、多聚半乳糖醛酸及少量蛋白质、胞外酶;二是具有络合、鳌合能力的小分子的可溶性有机物，主要有可溶性糖、氨基酸、有机酸、酚类等，它们可以为根际微生物提供重要的碳源;三是其他有机分泌物，主要是维生素、生长素、胆碱、烟酸［2-4］。最初对根系分泌物的研究主要局限在小分子物质一类，具有代表性的是张福锁等对麦根酸植物铁载体的研究。另外，研究发现，植物在高浓度的金属胁迫下能够形成植物螯合肽(Phytochelatins，PCs)。PCs既可以在根际环境存在，又可以在植物体内存在。PCs主要起到对过量金属的解毒和维持微量金属元素体内平衡的作用。然而，PCs是否由相关的基因控制还有待于进一步的研究［5］。根系分泌蛋白作为根系分泌物的重要成分近年来逐渐成为研究热点。分泌蛋白参与植物相关的根系胞外信号途径、形态发生、细胞凋亡、细胞分化等多种生物过程，并且根系分泌蛋白还对土壤养分有化学活化作用、修饰土壤且提高植物的抗逆能力。同时，根系分泌的酶类蛋白是对土壤酶的一个补充，并且影响根系蛋白分泌的因素除与植物种类及其生理特性有关外，还与外界环境密切相关。这其中主要包括养分胁迫、根际微生物等。Doloressa等［6］根据内质网和内质网信号肽在蛋白质合成中的作用，把嗜热细菌来源的木聚糖酶、水母的绿色荧光蛋白和人胎盘分泌的碱性磷酸酶(SEAP)3种重组蛋白定位到质外体中，通过根分泌和叶分泌途径获得表达，从而建立2种新的重组蛋白表达系统——植物根分泌和叶分泌，简化分离和纯化程序，为利用转基因植物大规模生产重组蛋白提供潜在的途径，同时表明根分泌途径与内质网分泌途径具有相似性。但是，根系分泌蛋白较少，而且多数分泌蛋白是酶类蛋白，富集、分离、鉴定工作繁杂、效率低;同时，植物分泌蛋白水平处于动态变化中，往往导致分泌蛋白质组学的试验结果重复性差，目前对植物根系分泌蛋白的研究相对集中在胁迫条件下根系对逆境环境应答方面的研究［7-9］。

1 分泌蛋白的主要分泌机制

在植物生长、发育过程中，细胞之间必须进行信息传递以保证基本的生命活动。其中，蛋白质分泌就是细胞间进行信息传递的重要方式之一。

蛋白质分泌包括2条基本的途径。一是经典分泌途径。在这一途径中，蛋白质N端具信号肽序列，且依赖于内质网(ER)和高尔基体(Golgi apparatus)，即ER-Golgi途径。二是非经典的分泌途径。分泌蛋白不含N端信号肽序列，其分泌过程不依赖于ER-Golgi。非经典分泌又包括至少4种不同的分泌方式(图1)［10］。

1.1 经典分泌途径 在经典分泌途径中，ER参与初生蛋白的合成、折叠、组装、转运与分泌［11］。蛋白质的合成都是从细胞质中游离核糖体上开始的。经典的内质网-高尔基体蛋白质在其N端具有信号肽序列。当合成的信号肽序列被信号识别颗粒(SRP)识别结合后，肽链延伸终止，此后SRP与受体结合，SRP脱离信号肽，蛋白质合成重新开始，与此同时信号肽引导新肽链进入内质网腔，而信号肽序列则在信号肽酶的作用下被切除，肽链延伸到终止。进入内质网腔的多肽链还要经过各种修饰加工，如糖基化(Glycosylation)、羟基化(Hydroxylation)、酰基化(Acylation)和二硫键(Disulfide bond)的形成等。糖基化伴随着多肽链的合成同时进行，是内质网中最常见的多肽链加工方式。在内质网腔中加在多肽链上的寡糖链，还要在高尔基体中进行一系列复杂的加工才能成为有活性的分泌蛋白。在合成过程中，多肽链在内质网腔中要进行折叠。不能正确折叠的多肽链一般不能进入高尔基体，而在内质网腔中很快地被降解［12］。

1.2 非经典蛋白质分泌途径 近年来研究发现，在真核细胞中存在着一类无信号肽的分泌蛋白。这些在细胞外有明确功能的蛋白质且不含有信号肽的分泌蛋白不依赖于ERGolgi途径，而是通过其他途径进行分泌。这类分泌途径被称为非经典分泌途径［10］。它们的分泌不需要ER-Golgi的参与，因此ER-Golgi分泌途径的抑制剂布雷菲尔德菌素A(BFA)和莫能菌素不能抑制非经典蛋白的分泌。蛋白的非经典分泌是有选择性的，不是细胞内容物被动释放的结果，而且不伴随着其他诸如LDH等细胞死亡标志物的出现［13］。因此，这一类蛋白被称为非经典分泌蛋白。

非经典蛋白质分泌途径作为另一种广泛存在的蛋白质分泌方式，在胞外信号途径、形态发生、细胞凋亡、细胞分化等多种生物过程中发挥着重要作用，是“内质网-高尔基”途径有效的补充和替代。以下是真核细胞非经典分泌蛋白的特点:①蛋白质的相对分子量为12～45 kDa，没有有功能的信号肽，通常由胞质内游离核糖体合成;②这些蛋白质多为单体，有不参与形成二硫键的半胱氨酸残基，它们不需要经过ER-Golgi的翻译后修饰;③ER-Golgi的蛋白分泌途径的抑制剂布雷菲尔德菌素A不能抑制非经典蛋白分泌途径［14］;④非经典分泌途径被证明依赖于能量和温度，并且在多种条件下被抑制或激活，是可调控的［15-16］;⑤非经典蛋白分泌过程被 NK-κB 依赖的信号传导途径［17］、细胞分化［18］和转录后修饰(如磷酸化)等所调控［19］。

尽管非经典分泌蛋白有许多共同的特征，但不同的分泌蛋白也有其各自的分泌机制，主要分为组成型和调节型分泌。目前已有4种非经典蛋白分泌途径被广泛报道，分别是①经多囊体(MVBs)分泌;②经液泡与细胞膜融合的分泌;③不依赖于高尔基体的胞质蛋白分泌，如甘露醇脱氢酶(MTD)和潮霉素磷酸转移酶(HYG®);④经双层膜细胞器EXPO 的分泌［10］。

1.2.1 MVBs介导的蛋白分泌途径。MVBs介导的蛋白分泌在动物中研究报道较多。近年来，越来越多的研究表明植物中同样存在MVBs介导的蛋白分泌过程［20］。MVBs在植物细胞中也被称作液泡前体(Prevacuolar compartments，PVCs)或晚期胞内体(Late endosomes，LEs)。在植物受真菌等病原体感染时，往往会诱导植物体启动MVBs介导的蛋白分泌。这种由MVBs分子机器介导的非经典蛋白分泌在植物体内独具特色。病程相关的货物蛋白通过该途径转运至胞外病原感染的乳突部位［21-23］。关于MVBs的来源，既有源于质膜的转内吞作用，又有重新生物合成的［22-24］。Scheuring等［25］以拟南芥为材料的研究表明，植物中的MVBs起源于TGN/EE。在这一形成过程中，需要内吞体分选转运复合体(Endosomal sorting complex required for transport，ESCRT)的参与且形成管腔内空泡，也需要膜联蛋白(Annexin)以完成MVBs作为运输载体向液泡的释放。ESCRT系统是真核细胞中完成胞内体(Endosome)膜内陷以形成多囊泡体(multi-vesicular body，MVB)的分子机器。ESCRT系统包括ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ、ESCRT-Ⅱ、ESCRT-Ⅲ和 Vps4-Vta1 共 5 个蛋白 - 蛋白复合物。晶体学研究已经解析了大部分复合物的结构。它促使膜内陷的分子机理一般认为分3步:首先是ESCRT-Ⅰ和-Ⅱ在内体膜上结合，并且促使内体膜内陷形成初始芽体;然后，ESCRT-Ⅲ在芽体颈部聚合，并且导致芽体的剪切，从而将内腔囊泡(Intralumenal vesicles，ILVs)释放到内体腔，形成MVB;最后，Vps4/Vta1复合物以水解ATP提供能量将聚合的ESCRT-Ⅲ解聚以循环利用，完成更多的出芽过程［26］。Nielsen等［27］用大麦白粉菌感染拟南芥时发现，仅有3种SNAREs(Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor adaptor protein receptors)分泌蛋白在侵染部位积累，分别是PENETRATION1(PEN1，也就是拟南芥中的AtSYP121)、ROR2(required for mlo-sjpecified resistanse 2，是大麦中PEN1的同系物)和AtSNAP33(即拟南芥中的soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor adaptor protein 33)。只有特殊类型的MVBs参与病原菌侵染的应激响应过程。

MVBs除参与病原应激响应外，还参与在正常生长条件下蛋白的非经典途径分泌。在动物细胞中，外泌体(Endosomes)是来自于MVBs和PM融合后的管腔囊泡［28］。不同研究者利用超速离心技术［29］、免疫荧光标记技术［30-31］、免疫电子显微镜技术［32］在不同植物的胞外空间(Extracellular space，ECS)也发现了类似的外泌体囊泡。也有研究发现，在向日葵幼苗的ECS中检测到不受BFA影响的LSP-jacalin相关植物凝集素(Helja)。该凝集素存在于类似外泌体的囊泡中［30］。越来越多的研究表明，MVBs是植物体内介导蛋白非经典分泌的重要方式之一。

1.2.2 不依赖于高尔基体的胞质蛋白分泌。不依赖于高尔基体的胞质蛋白分泌又称为高尔基体旁路分泌(Golgi-bypass pathway)。在动物体内，ARF-GEF抑制剂BrefildinA(BFA)是一种常被用来检测含信号肽蛋白是否经高尔基体旁路分泌的有效工具。在20多年前，第一次用该方法在植物中检测到多个高尔基体旁路分泌的蛋白，当时发现在烟草悬浮培养细胞液中存在多种多肽对BFA不敏感［33-34］。

迄今为止，在植物中发现的由高尔基体旁路分泌的蛋白主要有芹菜中的MTD和拟南芥中的HYGR两个。一般情况下，MTD是植物和真菌体内参与代谢与渗透调节的重要的碳水化合物。Cheng等［35］应用透射电子显微镜法观察到MTD在病原防御相关的植物激素水杨酸(SA)的诱导下会分泌至细胞外空间。该蛋白不含信号肽序列，是典型的无导肽分泌蛋白(LSP)。用高尔基体抑制剂Brefeldin A(BFA)处理，发现MTD分泌对BFA不敏感，也就是说其分泌不依赖于高尔基体。MTD通过非经典分泌途径可实现其多样性的细胞功能。在正常条件下MTD参与细胞内的代谢与渗透调节功能，而在病原侵染等逆境条件下MTD可通过非经典分泌途径分泌至细胞外，并且将病原真菌分泌的甘露醇降解，以防其对活性氧的猝灭作用。这是因为活性氧对真菌的侵染有重要的抑制作用。HYGR是Zhang等［36］在拟南芥中发现的第2个存在于植物中的由高尔基体旁路分泌的无导肽分泌蛋白。它可以磷酸化和钝化潮霉素B。利用荧光免疫检测技术和免疫金标记技术，发现拟南芥的突触结合蛋白SYT2(Synaptotagmin 2)定位于高尔基体，SYT2与HYGR-GFP共表达，导致转基因拟南芥对潮霉素B的超敏反应。在细胞内和胞外空间均被检测到，但其分泌对BFA处理不敏感，表明其分泌不依赖于高尔基体的介导，而是受定位于高尔基体的SYT2的调控，并且通过非经典途径分泌，但对于这一分泌途径的机制了解甚少。

1.2.3 液泡与质膜融合介导的蛋白分泌途径。有研究表明，当受到病原细菌侵染时，拟南芥的液泡会与质膜在感染部位融合而将植物防御相关的液泡酶分泌至质膜外，以实现对生物胁迫的应激反应［37］。在该融合过程中需要蛋白酶体复合物的催化。研究表明，组成蛋白酶体的3个组分中任意一个被沉默，那么液泡与质膜的融合就会被抑制［38］，而该融合过程的抑制剂可以被蛋白酶体复合物降解，不过这种抑制剂到目前还未被分离、鉴定出来［18］。众所周知，液泡的常规功能是维持植物细胞的完整性，即保持细胞的膨胀压。因此，液泡与质膜融合的存在就必然给人们带来很多疑问，比如，该融合过程中植物细胞如何实现病原防御?如何在液泡与质膜融合后保持细胞的完整性和活力?是否有新的液泡产生?

1.2.4 EXPO介导的蛋白分泌途径。胞外复合物(Exocyst comples)最早是在酵母中被分离、鉴定的［39］。后来，在动物［40］和植物［41］中相继被发现，包括其功能也被报道［42］。在酵母和动物细胞中，胞外复合物仅有一个拷贝，而在大多数植物细胞中则存在相当数量的旁系同源基因如EXO70s，在拟南芥中估计有23个旁系同源基因，而在水稻中可能有47个之多，但其功能尚未知［43-44］。植物中如此之多的EXO70s，表明不同的胞外复合物亚基可组合成更多的胞外复合物。这些胞外复合物除具有常规的质膜系留作用外，可能还具有其他特定的功能［45-47］。在细胞水平上，拟南芥中的AtEXO70E2亚基被用作探测鉴定新的细胞组分EXPO的有效工具［48］。由于与已知细胞器或内吞途径标记物FM4-64缺乏同源序列，又对常规的转运抑制剂BFA、wort-mannin或concanamycin A没有响应，EXPO被认为不参与经典的分泌途径或内吞途径。但是，AtEXO70E2-GFP和EXPO-GFP在细胞外被检测到，表明EXPO通过非经典途径分泌。另外，LSP:SAMS2(S-adenosylmethionine synthetase 2)在瞬时表达后可共定位于EXPO。这些研究结果表明，该蛋白是被EXPO逐步扣留并最终分泌到细胞外。SAMS2(S-adenosylmethionine synthetase 2，S-腺苷甲硫氨酸合成酶2)是目前唯一研究较深入的通过EXPO途径分泌的蛋白［48］。这是关于植物体内通过EXPO介导的非经典蛋白分泌的首次报道。

2 根系分泌蛋白的研究技术和方法

2.1 根系分泌蛋白的分离 根系分泌蛋白是混杂在根系分泌物中的。要想研究根系分泌蛋白，必须先获得根系分泌物。目前获得根系分泌物的方法有很多种，常用的有基质培养收集、溶液培养收集、土培收集等方法。根据不同的试验做出改进的方法，有分根收集装置［49］、自动连续收集系统［50］以及塑料管连接多孔陶土头减压原位收集［51］等。在根系分泌物收集之后，进一步作分离纯化等预处理才能进行有效的定性、定量分析，而常规的蛋白质分离方法如沉淀法、吸附层析、离子交换层析、凝胶过滤等方法对蛋白含量低且成分复杂的根系分泌物，很难获得其中的分泌蛋白成分。目前，分离蛋白的较有效的方法是分子膜法。在根系分泌物研究中广泛应用的便是分子膜与超速离心分离技术。不同分子量的分子膜孔径一般介于0.001～1.000 μm之间。利用分子膜结合超滤浓缩技术，可将根系分泌物细菌、杂质甚至病毒和蛋白质、氨基酸及多肽有效地分离开来，在分离出分泌蛋白的同时防止微生物对根系分泌物的降解［52］。

2.2 根系分泌蛋白的定性定量分析 根系分泌蛋白是根系分泌物中的一种重要的成分。常见的根系分泌蛋白主要是一些酶类物质。根系分泌物中存在大量的酶，如转化酶、磷酸酶、蛋白酶、淀粉酶、RNA酶和DNA酶等。它们对修饰土壤起一定的作用，如番茄根释放磷酸酶、玉米根释放水解酶。植物根系分泌蛋白对植物正常的生长发育有重要的作用。因此，分泌蛋白组的研究是国内外学者近年来研究探索的重要领域。这是由于分泌蛋白组不同于组织和细胞蛋白质组，其分泌量低，干扰物多，又受收集、浓缩等过程的限制［53］。目前，关于植物根系分泌蛋白的报道还相对较少。

根系分泌蛋白主要通过以下方法来鉴定。植物蛋白质组学研究中最常用的方法是双向电泳与质谱联用［54］，但由于该方法要求上样量大，低丰度蛋白质难以检测，所以不适合分析、鉴定植物根系分泌的量少且干扰物质多的分泌蛋白。传统的Edman降解法测定的肽序列准确，虽然测定肽段序列的速度较慢，花费较高，但目前依然是一种可靠的鉴定蛋白质的方法。随着Edman降解法在微量测序等方面的重大突破，它在蛋白质组学研究中仍发挥着重要作用［55］。生物质谱技术具有极高的灵敏度和高能量。它是把样品分子离子化后，根据不同离子间的质荷比(m/z)的差异来分离且确定相对分子量，采用生物质谱技术鉴定蛋白质主要是根据蛋白质酶解后的肽质量指纹图谱和肽序列信息去搜索蛋白质或核酸序列库［56］。鸟枪法(Shotgun)则是运用生物质谱技术，并且集成2种或2种以上色谱分离鉴定技术实现对蛋白质混合物的高通量分离鉴定。Shotgun技术的关键是对获得的全蛋白进行全酶切，得到多肽混合物，之后对其进行两维或多维色谱分离在线串联质谱分析［54］，然后通过蛋白质数据库检索，从而鉴定蛋白质。马玮等［57］运用Shotgun技术共鉴定得到玉米根系分泌物中的2 848个蛋白，获得较完整的玉米根系分泌蛋白图谱。Shotgun技术具有更高的灵敏性，更适合对低丰度蛋白质、干扰物多的植物根系分泌蛋白组进行鉴定，并且能够获得完整、可靠的蛋白质组表达信息。

2.3 生物信息学对根系分泌蛋白的预测与分析 近年来，随着计算机技术和互联网技术的快速发展，各类生物信息学软件及各类分子生物信息学数据库不断涌现，并且在生命科学领域中的作用日益广泛。与测定蛋白质的细胞定位不同，生物信息学方法利用多种序列分析程序，根据蛋白序列的编码特征，可以实现蛋白质亚细胞定位的高通量分析。对于分泌蛋白的生物信息学鉴定方法，目前常应用三类软件的组合分析，来预测一个蛋白质的亚细胞定位及其可能的分泌途径。目前常用的用于分泌蛋白预测的软件列于表1。苏源等［68］应用信号肽分析软件SignalP v3.0、亚细胞定位预测软件TargetP 1.1、GPI锚定位点预测软件big-PI Predictor和跨膜螺旋分析软件TMHMM2.0等4个软件分析了稻瘟菌12 595个蛋白序列，发现有1 134个为分泌蛋白(约占全部蛋白的9%)，其中435个分泌蛋白有功能注释，主要是代谢相关的酶类，其中细胞壁组分降解相关的酶有45个，还有相当数量的酶与致病相关。SUBA3是由澳大利亚西澳大学(University of Western Austrilia)计算系统生物学中心创建、维护的拟南芥蛋白亚细胞定位数据库(SUBA3，SUBcellular location of proteins in Arabidopsis)。该数据库创建于2007年。亚细胞定位的信息来自于通过实验测定的亚细胞定位数据和利用生物信息学软件预测分析的数据。最新版本的数据库中亚细胞定位信息涉及22个预测分析程序，分别是Ada-Boost、ATP、BaCelLo、ChloroP 1.1、EpiLoc 、iPSORT、MitoPred、MitoProt、MultiLoc2、Nucleo、PCLR 0.9、Plant-mPLoc 、PProwler 1.2、Predotar v1.03、PredSL 、PTS1、SLPFA、SLP-Local、Sub-Loc、TargetP 1.1、WoLF PSORT 和 YLoc，可见生物信息学软件在分泌蛋白预测分析中具有越来越重要的作用［69］。

表1 应用于植物分泌蛋白预测分析的主要生物信息学软件

3 展望

根系作为植物生长发育不可缺少的重要器官，在养分与水分的吸收、土壤生物和非生物逆境(如病虫害、干旱、淹水、养分缺乏、土壤污染、土壤酸化等)适应中发挥重要作用。了解不同生长条件下根系分泌蛋白的表达，对合理利用植物资源、提高作物产量与品质具有重要生产实践意义。近年来，根系研究已成为植物科学研究领域中一个重要的研究方向。而了解根系蛋白分泌的调控作用和机制，从而将这些知识更好地运用于农业生产中，是农业生产中一个迫切的任务。目前科研人员面临的挑战在于弄清根系分泌中的运输系统和调节机制，从而有助于我们更好地了解根系分泌的化合物以及它们在根际中的作用;另外一个重大挑战是对根系分泌的低丰度蛋白的分离与鉴定，并且最终阐明其生物学功能。根系分泌蛋白为土壤中的微生物提供了氮源和能源物质。微生物活动所分泌的蛋白同样对根系分泌蛋白研究进展产生一定的影响。那么，相应的无菌培养系统将会成为未来研究的新方向。传统生态学方法与现代生物学技术结合，有助于阐明根系分泌物与根际微生物间的相互作用。

在蛋白组学日益发展的今天，它在根系分泌蛋白的分离、鉴定方面发挥着越来越重要的作用。比如，早在20世纪90年代中期，就报道了在植物中非经典分泌蛋白的存在，但只是近年来随着蛋白组学技术的快速发展，大量的分泌蛋白才陆续被报道，并认为有高达70%的分泌蛋白是通过非经典途径分泌的，也就是说，大部分分泌蛋白的胞外转运是不依赖于经典的ER-Golgi途径的［20］。因此，发展高能量的定量蛋白组学技术是快速鉴定根系分泌蛋白的重要技术保证。

仅以试验手段去捕获生物中重要分泌蛋白且做深入研究的效率是有限的，而通过生物信息学的手段高通量地获悉生物中某一类型的蛋白，在此基础上进一步筛选以获得感兴趣的蛋白，是一种简单、高效的方法。目前，虽然大部分生物信息学软件可以预测蛋白组中可能的分泌蛋白，但仍存在较高的假阳性。如何对其进行准确鉴定，并从中挑选出有意义的目标蛋白并且对其进行功能测定，是亟待解决的另一问题［70-71］。

另外，已知分泌蛋白多为病原微生物与植物受体蛋白起作用的激发子和其他致病因子。结合计算机技术和生物信息学的方法，深入研究分泌蛋白组学，有助于为全面掌握植物与病菌相互作用的分子机制。同时，对植物的根系逆境条件下分泌蛋白的抗性机制研究具有重要的实践意义。

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