HPLC法测定刺五加糖浆中五味子醇甲的含量

康宏玲，王志强

(1.沈阳工学院生命工程学院，辽宁抚顺 113122;2.抚顺市消防支队清原县消防大队，辽宁抚顺 113300)

刺五加糖浆为益气健脾、补肾安神的方剂，主要用于脾肾阳虚、体虚乏力、食欲不振、腰膝酸软、失眠多梦，其主要成分为刺五加浸膏、五味子浸膏［1］，原标准只是对刺五加苷含量进行测定，并没有测定其中五味子相关成分的报道，方剂五味子中的木脂素类化合物为其有效成分，具有益气生津、收敛固涩、补肾宁心的功效［2］，其中五味子中木脂素类化合物以五味子醇甲的含量居高［3］。笔者采用RP－HPLC法测定刺五加糖浆中五味子醇甲的含量，以便对其方剂的品质进行更好的了解和监督，为刺五加糖浆的质量控制提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器 Agilent HP1100高效液相色谱仪(配有四元梯度泵、在线真空脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器);ES－120型电子天平(沈阳龙腾电子称量仪器有限公司);超纯水发生系统(MILLIPORE公司);DHG－9023A型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司);TurboVapLV氮气吹干仪(Zymark公司);CX－300W超声波清洗机(北京市医疗设备二厂);LG10－2.4A型高速离心机(北京医用离心机厂);一次性使用无菌注射器(上海凯乐输液器厂);Ф13 mm 0.22 μm一次性微孔样品过滤膜(希波氏)。

1.2 试药 刺五加糖浆(哈尔滨东方制药有限公司);乙腈，色谱纯(Fisher Chemicals公司);甲醇，色谱纯(Fisher Chemicals公司)，五味子醇甲为化学对照品(中国药品生物制品检定所);无水乙醇，分析纯(安徽安特生物化学有限公司);乙酸乙酯，分析纯(国药集团化学试剂有限公司);水为超纯水。

1.3 试验方法

1.3.1 对照品溶液的制备。标准储备液1 000 μg/ml:准确称取五味子醇甲标准品0.010 0 g，加入乙腈溶解转移于10 ml容量瓶中定容至刻度，混匀，制备成1 000 μg/ml的对照品溶液，备用。

1.3.2 供试品溶液的制备。取刺五加糖浆10 ml于比色管中，加水10 ml，用10 ml乙醇溶液萃取5次，合并每次乙醇萃取液，挥干乙醇液，将残渣用乙腈定容于25 ml容量瓶中，混匀，取适量溶液进行高速离心分离后经0.22 μm微孔滤膜过滤上层清液后待测。

1.3.3 色谱条件。色谱柱为Diamonsil(钻石)C18(250 mm×4.6 mm，5 μm，迪马公司)，流动相为乙腈和水，流动相配比为乙腈∶水=50∶50(V/V);DAD检测器，检测波长为216 nm;流速为0.8 ml/min;进样量为10 μl;柱温为25℃。

1.3.4 方法学考察。

1.3.4.1 标准曲线的绘制。分别精密吸取五味子醇甲标准储备液0.01、0.02、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00 ml于10 ml容量瓶中，加入乙腈溶解定容混匀，分别取10 μl注入高效液相色谱仪中进样分析，以进样浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.4.2 精密度试验。准确吸取标准溶液(1.00 μg/ml)按照“1.3.3”色谱条件连续进样分析6次，测定峰面积并计算RSD值。

1.3.4.3 稳定性试验。准确吸取供试品溶液在0、4、10、14、18、22、24 h分别进样分析，测定峰面积，计算其RSD值。

1.3.4.4 重复性试验。取同一供试品样品8份，按照“1.3.2”方法制备溶液进样分析，测定峰面积，计算其RSD。

1.3.4.5 回收率试验。试验采用标准加入法进行回收率试验。取已知含量的供试品样品6份(五味子醇甲的含量为40.12 μg/ml)，每份准确量取 10.00 ml，加入200 μg/ml标准溶液2.00 ml，按照“1.3.2”方法制备样品溶液，制成加样供试品，取加样供试品10 μl，注入高效液相色谱仪中进样分析，测定五味子醇甲的加标回收率并计算RSD值。

1.3.5 样品含量测定。取5批供试品样品，按照“1.3.2”方法处理样品，在“1.3.3”色谱条件下进样分析，测定样品中五味子醇甲的含量。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 标准曲线的绘制。通过绘制标准曲线，得到五味子醇甲的线性回归方程为Y=68.654X－5.127，相关系数为0.999 7，由此可以看出五味子醇甲的线性关系良好，可以满足日常分析的要求。

2.1.2 精密度试验。在相同条件下对对照品连续进样6次，结果五味子醇甲峰面积的RSD值为0.8%，表明该仪器的精密度良好，测定结果可靠。

2.1.3 稳定性试验。经测定不同时间的供试品溶液，结果五味子醇甲峰面积的RSD值为1.3%，表明供试品溶液在24 h内可以稳定存在。

2.1.4 重复性试验。取同批次样品8份，在同一试验条件下进样测定，得出五味子醇甲峰面积的RSD值为0.9%，可见该方法的重复性良好。

2.1.5 回收率试验。从五味子醇甲加标回收率的结果(表1)可知，其平均加标回收率为96.32%，RSD值为2.3%，表明该方法精密度和准确度高，可满足分析检测的要求。

表1 五味子醇甲的加标回收率

2.2 样品含量测定 在确定的最佳试验条件下，5批次供试品中五味子醇甲含量的测定结果分别为40.12、42.06、41.29、39.84、42.81 μg/ml(n=3)。

3 讨论

3.1 流动相组成的确定 在高效液相色谱分析中，流动相的恰当选择对改善分离效果起到重要的作用。从实用角度考虑，流动相的溶剂应当使用安全、容易购得、纯度高。除此之外，流动相溶剂应使色谱柱的柱效不受影响，保持色谱柱的稳定。该试验考察了甲醇－水和乙腈－水2种流动相体系对样品分离情况的影响，结果表明在相同配比的2种流动相体系中应用乙腈－水为流动相会使分析时间大大减少，并能有效地改善峰形，使峰形变窄，对称性好，且分离度和洗脱的效果更好，减小了包峰和拖尾的现象，所以该试验采用乙腈－水为流动相。

3.2 流动相配比的确定 试验考察了不同流动相配比对样品分离的影响，发现当流动相配比中乙腈的比例过小，会增加分析时间，使色谱峰变宽，但乙腈的比例过大，使样品中五味子醇甲与周围干扰物质无法分离，出现严重的包峰现象，综合考虑分离度、时间和峰形等因素，试验选择乙腈∶水=50∶50的流动相配比。从图1可看出，在13.7 min时均出现五味子醇甲的色谱峰，且样品中五味子醇甲与周围干扰峰分离良好。

3.3 流速的确定 流动相的流速会对色谱柱的保留时间、柱效能及柱压产生影响。该试验分别考察了0.6、0.8、1.0、1.2 ml/min 4种流速下对保留时间、柱效能及柱压的影响，结果表明流速增大，五味子醇甲的保留时间缩短，但柱压升高;流速太小，柱压减小，但色谱峰加宽，分析速度慢，当流速为0.8 ml/min时，理论塔板数最大，柱效能最好，为此试验选择0.8 ml/min为最佳流速。

3.4 进样量的确定 在高效液相色谱中，进样量是影响检测器灵敏度的重要因素之一。此外，进样量的大小还会影响色谱峰的峰形，甚至影响分离度。进样量太小，被测物质不易被检出，灵敏度低;进样量太大，易发生峰变形、拖尾等现象，使色谱峰对称性下降。该试验以样品溶液分别进样5、10、15、20 μl比较不同进样量对色谱分离的影响，结果发现当进样量＞15 μl时，五味子醇甲的色谱峰变宽，与周围干扰物质达不到良好的基线分离，为此试验考虑分离度和灵敏度等因素选择10 μl为最佳进样量。

3.5 柱温的确定 柱温是影响分离效能和分析速度的重要参数，该试验分别考察了柱温在20、25、30、35℃时对样品中各种物质分离度的影响，发现样品中五味子醇甲在25℃时与周围物质的分离度和柱效能最好，当温度＞30℃时分离度均小于1.0，说明分离不好，所以试验选择25℃为最佳柱温。

3.6 样品萃取溶剂的确定 试验中根据五味子醇甲的理化性质和相关参考文献，分别试用了甲醇、乙醇、乙酸乙酯作为萃取溶剂，结果发现甲醇的挥发速度很快，且检测波长在216 nm时出现甲醇溶剂峰的干扰，乙酸乙酯作为萃取溶剂，萃取效果不佳，使测定结果明显偏低，为此该试验选择乙醇为萃取溶剂。

［1］张旭东，王蕊，张淑慧.复方刺五加糖浆的制备［J］.河北医药，2008，30(9):1418－1419.

［2］靳杰.中药五味子的研究进展［J］.黑龙江医药，2005，18(5):335.

［3］付绍平，张峰，张慧，等.反相高效液相色谱法测定五味子中木脂素的含量［J］. 现代中药研究与实践，2004，18(S1):32－34.