本溪地区鸭致病性大肠杆菌优势血清性的交叉保护研究

高行空 苑兴君

鸭致病性大肠杆菌（EPEC）感染是鸭个体被致病性大肠杆菌部分或全身感染的疾病。现有本溪地区的禽病源性大肠杆菌（Avian Pathogenic Escherichia Coli， APEC）的研究数据多数来源于鸡，缺乏鸭源EPEC病原特性的系统研究。鸭大肠杆菌病的病理特征多样、临床症状复杂、致病菌耐药性差异大且不同血清型之间可能存在交叉保护。在鸭规模化饲养过程中，由大肠杆菌感染致死造成的损失较为常见，一直是困扰禽类养殖业的发展。近年来，随着鸭规模化养殖逐步形成，禽流感、新城疫等主要疾病得到有效控制，大肠杆菌病因其重视程度差、防止效价低导致和致病性大肠杆菌在抗生素滥用下耐药性不断增强，患病率呈明显上升趋势。辽宁省本溪地区养鸭业发展迅速，研究本溪地区鸭源大肠杆菌O15、O35优势血清型之间的交叉保护关系，确定单血清疫苗免疫保护是否有应用价值，以及交叉免疫导致大肠杆菌病变的能力强弱，对鸭大肠杆菌病的科学免疫有重要意义。

1试验动物

实验选用采购于沈阳茂华生物科技有限公司的1周龄雏鸭，饲养1周取健康、敲击实验笼反应正常的雏鸭45只。

2免疫菌液的制备

一级菌种制备：将筛选出O15和O35二种型菌株，在操作台上用接种环涂布于麦康凯琼脂基上，在37℃恒温环境中连续培养24h，筛选典型菌落于标准琼脂继续培养24h，无菌、低温环境备用。

二级菌种制备：将一级菌转移到普通肉汤，37℃连续震荡24h。吸取培养后菌液与普通琼脂以1：1比例混合后在37℃再克氏瓶中培养24小时。用0.9%NaCl溶液冲洗克氏瓶，经无菌纱布过滤后无菌、低温环境备用。

活菌计数：无菌条件下，移取二级菌种液lmL，按1：10逐步稀释，按常规平板计数法使二级菌种液活菌含不低于1×1010 个/mL。

灭活：将二级菌悬液中加入0.4 %甲醛溶液，在37℃环境中静置3d，每6～8h搅拌混匀。

内毒素检测：移取0.1mL鲎试剂置于10×75mm玻璃试管中，便震荡边滴加0.1mL灭活菌液，在37℃水浴中放置1h，观察结果。

3氢氧化铝佐的制备

在60℃温度下，移取8%氧化铝溶液44mL，与42mL 4%的氢氧化钠溶液搅拌混合，至出现铝胶凝聚。调整pH至5.6～6.0，高温灭菌2h后与二级菌液1：1混合，无菌、低温环境备用。

4免疫菌液的检验

物理检验：肉眼观菌液颜色，混悬状态等。

无菌检验：将制备好的二级菌液分别经过T.G、GA、GP，检查是否有菌落出现。

安全性检验：选取10只1周龄雏鸭，经腹部皮下注射0.2mL灭活菌液，记录10d内雏鸭健康状态，如果无不良反应则合格。

5方法

5.1大腸杆菌的交叉保护研究

随机选取2周日龄雏鸭35只，分7组每组5只，每只经腹部皮下注射免疫菌液0.2mL。每组雏鸭分笼饲养，所用雏鸭接触实验器材分组使用，观察1周后进行二次免疫，方法与初次免疫相同，观察1周。二次免疫后，对雏鸭感染攻毒株菌液0.2mL/只。记录发病时间、死亡时间。继续饲养1周，颈椎脱臼法杀死所有雏鸭，无菌采集心脏和肝脏，分组情况为：

A组：初次和二次免疫苗为O15免疫株，用O15毒株感染，观察雏鸭健康状态。

B组：初次和二次免疫苗为O35免疫株，用O15毒株感染，观察雏鸭健康状态。

C组：初次和二次免疫为安慰剂，用O15毒株感染，观察雏鸭健康状态。

D组：初次和二次免疫苗为O15免疫株，用O35毒株感染，观察雏鸭健康状态。

E组：初次和二次免疫苗为O35免疫株，用O35毒株感染，观察雏鸭健康状态。

F组：初次和二次免疫为安慰剂，用O35毒株感染，观察雏鸭健康状态。

G组：空白组，初次和二次免疫为安慰剂，用安慰剂感染，观察雏鸭健康状态。

5.2试验结果

未经免疫的雏鸭在感染O15和O35毒株后全部死亡;接受O15免疫后的雏鸭在感染O15毒株后个体健康无病变，在感染O35后全部死亡;接受O35免疫后的雏鸭在感染O35毒株后个体健康无病变，在感染O15后全部死亡;空白对照组雏鸭无死亡，剖检观察相应器官无病变。

5.3讨论

试验表明，单一免疫苗只对相应的毒攻株有免疫作用，但是对于不同的血清型的菌株无免疫作用，进一步证实了O15和O35之间无在交叉保护影响。因此，由于大肠杆菌在养殖场中多种血清型混合生长，单一菌的免疫不能满足养殖场广泛免疫的要求。建议本溪地区鸭养殖场在大肠杆菌免疫时，使用O15和O35的多价疫苗。经过雏鸭解剖，我们还发现虽然免疫苗对于不同的血清型的菌株无免疫作用，但接受过免疫个体被毒攻后的病征明显弱于未经免疫的雏鸭。

本试验还考虑到细菌内毒素的干扰。细菌内毒素是大肠杆菌细胞壁上特殊结构脂类，在受到特异性激活时分泌特殊递质，控制中性粒细胞释放热源。在交叉保护试验中内毒素可能引起内毒素休克，出现内循环紊乱，体内酸中毒。本试验前的鲎试验和安全性验证已经保证灭活的菌液中内毒素全部去除。

所分离的鸭致病性大肠杆菌O15，O35优势血淸型在雏鸭上不存在交叉保护。

（作者单位：117000辽宁省本溪市农业综合发展服务中心）