拟轮枝镰孢菌毒素粗提液对玉米种子发芽及幼苗生长的影响

刘春元 邢小萍 韩卫丽

摘要 为建立玉米杂交种和自交系利用拟轮枝镰孢菌毒素抗性筛选的试验方法，制备拟轮枝镰孢菌毒素粗提液，测定不同稀释倍数毒素粗提液对2个玉米杂交种和4个玉米自交系处理4 和6 d后的种子发芽抑制率、胚根生长抑制率以及幼苗致萎效果，分析不同抗性玉米种质、毒素稀释倍数和处理时间对玉米种子发芽、胚根和幼苗生长的影响。结果表明，易感杂交种豫玉22与抗性杂交种农大108的种子发芽抑制率和胚根生长抑制率均存在极显著差异（P<0.01）;在处理后4、6 d时，前者的种子发芽抑制率、胚根生长抑制率分别比后者高7.2%、11.3%、12.7%、11.8%。在对玉米杂交种幼苗致萎蔫试验中，用稀释2倍和5倍的毒素粗提液处理，豫玉22与农大108杂交种幼苗间的萎蔫程度也存在显著差异（P<0.05）。拟轮枝镰孢菌毒素粗提液对不同抗性玉米种质种子发芽、幼苗生长的影响存在显著差异，为利用拟轮枝镰孢菌毒素粗提液对玉米品种进行苗枯病抗性鉴定和筛选提供理论依据。

关键词 玉米苗枯病;拟轮枝镰孢菌;毒素粗提液;发芽率;胚根生长

中图分类号 S432.1文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）19-0158-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.19.046

Abstract In order to establish a simple method for evaluating the resistance of maize hybrids and inbred lines，  the crude toxin extract from the culture medium of Fusarium verticillioides was prepared ， and  the seed germination inhibition rate， radicle growth inhibition rate， as well as the wilting degree of 2 maize hybrids and 4 inbred lines under the treatment of the crude toxin at various dilutions and different treatment duration （4 or 6 d） were determined. The results showed that the susceptible hybrid Yuyu22 and resistant hybrid Nongda108 significantly differed in the inhibition rates of seed germination and radicle growth （P<0.01）， and the inhibition rates of seed germination and radicle growth of Yuyu22 were 7.2%， 11.3% and 12.7%， 11.8% higher than those of Nongda 108. An obvious difference between Yuyu22 and Nongda108 was also found under the treatment of the crude toxin extract at 2 and 5 diluted solution （P<0.05）.

The effects of crude extracts of fusarium rotatum toxin on seed germination and seedling growth of different resistant maize germplasms were obviously different， which provided certain basis for identification and screening of resistance to bacterial blight of maize varieties by using crude extracts of fusarium rotatum toxin.

Key words Maize seedling wilt disease;Fusarium verticillioides;Crude toxin extract;Germination rate;Radicle growth

玉米苗枯病是玉米生產中发生广泛、为害严重的病害之一。近年来，由于感病品种推广、种子带菌、栽培管理粗放及环境条件改变等原因，导致该病频繁发生，对玉米生产造成严重影响[1-3]。引起玉米苗枯病的病菌主要有镰孢菌、立枯丝核菌、腐霉菌等。其中，拟轮枝镰孢菌（Fusarium verticillioides）是主要病原菌之一[4-7]。该病菌寄主范围广泛，能侵染玉米、小麦等多种粮食作物，常引起苗枯、茎腐、穗腐等症状，对作物生产造成严重损失。该菌有性态为藤仓赤霉（Gibberella fujikuroi），在为害寄主的过程中，能产生多种非寄主专化毒素，对人和动物有很强的毒性[8]。研究表明，除影响粮食及其产品安全外，该类毒素还与人类癌症发生有关[9-10]。

利用抗病品种是防治该病的有效措施之一[7]。近年来，利用病原菌毒素进行抗性材料的筛选逐渐成为品种抗性鉴定的一项重要方法。该方法可以快速、简便地对大量材料进行初筛，目前已在稻瘟病菌[11-12]、棉花黄萎病菌[13]、小麦赤霉病菌[14]、烟草赤星病菌[15]等病原菌的抗性资源筛选中广泛应用。而针对拟轮枝镰孢菌毒素在玉米品种抗性鉴定中的应用较少。因此，笔者以引起玉米苗枯病的主要病原菌拟轮枝镰孢菌为供试病原菌，测定不同浓度的拟轮枝镰孢菌毒素粗提液对供试玉米杂交种和自交系的种子发芽和胚根生长的影响和幼苗的致萎蔫能力，分析毒素粗提液对玉米种子发芽和幼苗生长的影响，从而探讨利用病菌毒素粗提液筛选抗源材料的可能性，以期为利用毒素快速筛选抗源材料提供依据，加快抗病育种进程。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 玉米种子。

玉米杂交种：农大108，对玉米苗枯病表现抗病;豫玉22，对玉米苗枯病表现为感病。

玉米自交系：5008-1、熊掌S以及BT，对玉米苗枯病表现抗病;N6，对玉米苗枯病表现感病。

供试玉米材料分别由河南省农业科学院、郑州国家玉米改良分中心提供。

1.1.2 供试菌种。

从河南省玉米苗枯病的发病田间采集病样，经组织分离、纯化后，按柯赫氏法则进行鉴定，确定为拟轮枝镰孢菌，在4 ℃冰箱保存。

1.1.3 培养基。

Richard 培养基：硝酸钾（KNO3）10.0 g，硫酸镁（MgSO47H2O）2.5 g，磷酸二氢钾（KH2PO4）5.0 g，氯化铁（FeCl3）0.02 g，蔗糖50.0 g，蒸馏水1 000 mL。配制后分装，121 ℃下高压灭菌20 min。

1.2 试验方法

1.2.1 拟轮枝镰孢菌毒素粗提液制备。

将保存在4 ℃冰箱的拟轮枝镰孢菌转置PDA培养基平板上，25 ℃条件下培养7 d。在无菌条件下，用直径7 mm打孔器将长满病原菌的PDA培养基切成菌块，再转置于装有Richard培养液的三角瓶中，每瓶分装5个菌块。将三角瓶放在振荡培养箱（22 ℃，1 400 r/min）培养20 d，而后用12层纱布过滤。将滤出液在6 000 r/min下离心20 min，收集上清液，在121 ℃下灭菌20 min，冷却后备用。

1.2.2 拟轮枝镰孢菌毒素粗提液对玉米种子发芽和胚根生长的影响。

先将玉米种子用无菌水浸泡24 h，捞出滤干水分，加入75 %乙醇表面消毒5 min。然后用无菌水将消毒过的种子冲洗3次，摆放在铺有灭菌滤纸的250 mL三角瓶中，每三角瓶摆放20粒，加入50 mL稀释倍数分别为0、1、2、5倍的毒素粗提液，以无菌水为对照，用无菌滤膜覆盖瓶口，重复3次。将处理好的三角瓶放置于25 ℃、光暗比为12 h：12 h的恒温培养箱内培养，分别在培养4和6 d时调查，统计发芽率、胚根长度，按下列公式计算毒素粗提液对种子发芽的抑制率和对胚根生长的抑制率。

种子发芽抑制率=（对照种子发芽率-处理种子发芽率）/对照种子发芽率×100%

胚根生长抑制率=（对照胚根长度-处理胚根长度）/对照胚根长度×100%

1.2.3 拟轮枝镰孢菌毒素粗提液对玉米幼苗的致萎蔫作用。

玉米种子经75 %乙醇表面消毒5 min、无菌水冲洗3次后，播于装有无菌沙土（沙∶土=3∶1）的营养钵中，待玉米苗2叶期时，小心拔出幼苗，冲洗干净后，将切除根系的幼苗分别浸入装有不同稀释倍数的拟轮枝镰孢菌毒素粗提液的烧杯中，每处理3次重复，每重复20株，无菌水处理为对照。处理后24、48、72、96 h时观察记录玉米幼苗失水萎蔫程度[16]。

玉米幼苗萎焉程度分级标准：“-”，所有幼苗的叶片无萎蔫症状;“+”，一级萎蔫，供试材料中，叶片轻度失水萎蔫的幼苗占50%以上;“++”，二级萎蔫，供试材料中，整株叶片失水萎蔫的幼苗占50%以上;“+++”，三级萎蔫，供试材料中，整株叶片失水干枯的幼苗占50%以上。

1.3 数据分析 利用Excel计算标准误差，利用SPSS 16.0统计软件进行方差分析，多重比较用邓肯氏法。

2 结果与分析

2.1 拟轮枝镰孢菌毒素粗提液对玉米种子发芽的影响

由图1可知，毒素粗提液对玉米种子发芽的抑制作用与浓度、处理时间和玉米品种抗性有一定关系。处理4和6 d后，不同稀释倍数毒素粗提液对种子发芽抑制率的变化趋势基本相似（图1），不同稀释倍数的毒素粗提液对不同抗、感性的玉米杂交种和自交系种子的发芽抑制率均达显著水平（P<0.05），不同稀释倍数的毒素粗体液对玉米苗枯病表现感病的自交系品种N6的種子发芽抑制率达极显著水平（P<0.01），除毒素粗提液处理后6 d的感病杂交种豫玉22（P>005）外，毒素粗提液的稀释倍数与其他玉米品种处理后4和6 d的种子发芽抑制率均呈显著的负相关关系（P<0.05）（表1）。

由图1可知，拟轮枝镰孢菌毒素粗提原液对种子发芽的抑制率最高，其中，在毒素粗提液处理4 d时，抗病杂交种农大108的种子发芽抑制率为86.0 %，抗病自交系品种的种子发芽抑制率为61.0%～84.6%;对感病杂交种豫玉22 的种子发芽抑制率为92.6%，对感病自交系N6的种子发芽抑制率达94.2%;随处理后天数增加，在毒素粗提液处理后6 d时，感病杂交种和自交系品种的种子发芽抑制率分别达934%和95.3%;由图1可知，拟轮枝镰孢菌的毒素粗提液原液对同是抗病杂交种和自交系及同是感病的杂交种和自交系的种子发芽抑制效果基本一致。随稀释倍数增加，毒素粗提液对种子发芽的抑制率呈逐渐降低趋势，当稀释5倍时，处理4 d后的抗病杂交种农大108和抗病自交系5008-1的种子发芽平均抑制率分别为4.9%和-2.0%，感病杂交种豫玉22和感病自交系N6的种子发芽平均抑制率分别为8.1%和429%;处理6 d后的抗病杂交种农大108和抗病自交系5008-1的种子发芽平均抑制率分别为11.4%和1.3%，感病杂交种豫玉22和感病自交系N6的种子发芽平均抑制率分别为338%和44.7%。同一浓度毒素粗提液对玉米抗、感品种的种子发芽抑制率不同，毒素粗提液对感病杂交种和自交系玉米种子发芽的抑制率高于抗病杂交种和自交系的玉米品种（图1）。

2.2 拟轮枝镰孢菌毒素粗提液对玉米种子胚根生长的影响

由图2可知，拟轮枝镰孢菌毒素粗提液对玉米杂交种胚根生长的抑制作用与毒素浓度、处理后时间和试验材料的差异有关，随着病原菌毒素粗提液稀释倍数的增加，对供试玉米种的胚根生长抑制作用减小。毒素粗体液处理后4和6 d时，各稀释倍数的毒素粗提液对胚根生长的抑制效果变化趋势基本相同。拟轮枝镰孢菌毒素粗提液稀释倍数与玉米种子胚根生长抑制率呈负相关，但除感病杂交种豫玉22外，其余供试玉米杂交种和自交系的种子胚根生长抑制率与拟轮枝镰孢菌毒素粗提液稀释倍数间的负相关性未达显著水平（P>0.05），这与对种子发芽抑制的表现不同（表2）。由图2、表2还可以看出，拟轮枝镰孢菌毒素粗提液对玉米杂交种和自交系胚根的生长抑制作用不同，对杂交种胚根生长的抑制作用略强于自交系。拟轮枝镰孢菌毒素粗提液原液处理4和6 d后，抗病杂交种农大108胚根生长抑制率分别为931%和95.8%，而感病杂交种豫玉22的胚根生长抑制率高达100%。

2.3 拟轮枝镰孢菌毒素粗提液对玉米杂交种幼苗的致萎蔫作用

由表3可知，当拟轮枝镰孢菌毒素粗提液浓度较高（稀释倍数为0和1）时，抗、感杂交种幼苗间的萎蔫程度变化基本一致，均随处理时间延长而加重。在处理后96 h时，抗、感杂交种均表现3级萎蔫。当毒素粗提液浓度较低（稀释倍数≥2）时，抗、感杂交种幼苗间的萎蔫程度变化出现明显差异。在2倍稀释时，抗病杂交种农大108 在处理后48 h时才开始出现萎蔫;在处理后96 h时，萎蔫程度仅达2级。相对地，感病杂交种豫玉22在处理后24 h时即出现萎蔫，在处理后72 h达2级萎蔫。在5倍稀释倍数时，抗病杂交种在处理后72 h时才开始出现萎蔫，到96 h时，萎蔫程度仍为一级;感病杂交种豫玉22在处理后48 h即出现萎蔫，在处理后96 h时达到二级萎蔫。因此，利用致萎蔫作用试验评价玉米杂交种抗性时，稀释倍数以2～5倍为宜。

3 结论与讨论

镰孢菌毒素主要有单端孢霉烯类、玉蜀黍赤霉烯类和伏马毒素3类[17-19]，拟轮枝镰孢菌侵染寄主后可产生多种毒素，如伏马毒素、萎蔫酸、镰孢菌酸等，该类毒素可对动、植物的正常生长造成伤害[20]。植物受到病原真菌侵染后，病原菌产生的多种毒素可以作用于细胞质膜，影响细胞膜的透性改变;也可以直接作用于细胞核和核糖体，影响细胞分裂。拟轮枝镰孢菌产生的多种毒素，既可以影响细胞膜的透性，也可以影响寄主细胞的分裂，植物受害后通常表现萎蔫，或生长受到影响[21]。

该研究结果发现，拟轮枝镰孢菌毒素粗提液对玉米种子的发芽和胚根生长具有较明显的抑制作用，对供试玉米杂交种的幼苗也有明显的致萎蔫作用。拟轮枝镰孢菌毒素粗提液的作用效果与多种因素有关。首先，拟轮枝镰孢菌毒素粗提液的浓度对各项测定指标有较大影响。该研究发现，随稀释倍数的增加，毒素粗提液对玉米种子的发芽、胚根的生长、幼苗萎蔫程度等的影响作用减小，这与田雪亮等[6]的研究结果一致。无论是玉米杂交种还是自交系的种子发芽和胚根生长试验中都可以观察到，随稀释倍数的增加，抗病和感病杂交种材料间的抑制率差值有扩大趋势。在玉米杂交种幼苗致萎蔫试验中，在0～1倍稀释时，幼苗的萎蔫程度无差异;只有稀释倍数为2～5倍时，幼苗的萎蔫程度才会出现差异。综合该研究结果，在今后进行玉米抗性鉴定试验时，可考虑选用的比较适宜的拟轮枝镰孢菌毒素粗提液稀释倍数为2倍或5倍。其次，毒素作用时间对试验结果也有较大影响。在玉米杂交种试验中，4 d处理已经能很明确地区分不同抗性的种质，但6 d处理的种子发芽和胚根生长抑制率均显著高于4 d处理的对应值（P<0.01），因此今后鉴定试验中，应处理时间稍长。第三，玉米种质的抗性与种子发芽和胚根生长抑制率、幼苗致萎蔫效果等也存在一定关系。总体来看，在玉米杂交种种子发芽和胚根生长抑制试验中，毒素对抗性杂交种农大108种子发芽和胚根生长的抑制率在处理后4、6 d时比易感杂交种豫玉22的对应值分别低7.2%、11.3%、12.7%、11.8%，说明这2项试验能很好地区别抗性和易感玉米杂交种;农大108适宜作为种子发芽和胚根生长抑制试验中的抗性杂交种标准对照，而豫玉22也适合作为易感杂交种标准对照，应用于杂交种玉米抗性的初步鉴定。在玉米自交系种子发芽抑制试验中，毒素对易感自交系N6的指标均比对抗性自交系BT、熊掌S和5008-1的对应值分别高218%～262%、96.8%，且抗性自交系之间也存在一定差异，说明通过病原菌毒素粗提液对种子发芽抑制的测定试验，可大致区分部分感病和抗病自交系。但在胚根生长抑制试验中，感病自交系N6的均值分别明显高于抗性自交系熊掌S和5008-1的對应值，但与自交系BT的胚根生长抑制率无显著差异。今后应收集较大量的自交系材料，运用毒素粗提液进行鉴定，才能对鉴定材料的抗性结果作出较为客观的评价。

综上所述，今后在对较大量玉米种质资源进行玉米苗枯病抗性鉴定和筛选时，可以考虑结合利用拟轮枝镰孢菌毒素粗提液来进行鉴定，经对大量鉴定材料、多次鉴定结果比对后，如与利用病原菌鉴定差异不显著，可考虑用此方法部分代替玉米苗枯病菌进行品种抗性鉴定和筛选。此方法简便易行，可在室内较短时间对大量待鉴定材料进行鉴定，有效提高抗性鉴定的效率[22-24]。

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