梯度洗脱HPLC法同时测定4种驱虫药物的含量

吴昊 刘红云 张莉 吴蕾 明文庆 蔡一杰

摘要 [目的]建立梯度洗脱HPLC法同时测定4种驱虫类药物的含量方法。[方法]采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-0.2%磷酸溶液为流动相，梯度洗脱;流速1.0 mL/min，柱温为30 ℃，检测波长254 nm。通过液相保留时间、峰纯度检查和光谱相似度检查。[结果]该色谱条件下阿苯达唑、三氯苯达唑、盐酸左旋咪唑、地克珠利分离良好。阿苯达唑、三氯苯达唑、盐酸左旋咪唑和地克珠利均在10～200 μg/mL线性良好，平均回收率分别为98.6%、99.5%、100.3%、99.1%，RSD分别为1.2%、1.0%、1.4%、0.8%。[结论]该研究开发的方法简便、準确、可靠，可用于同时测定以上4种驱虫药物的含量测定。

关键词 阿苯达唑;三氯苯达唑;盐酸左旋咪唑;地克珠利;含量测定;梯度洗脱HPLC法

中图分类号 S859文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）14-0210-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.14.062

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract [Objective]The research aimed to establish a method for simultaneous determination of four anthelmintic drugs by gradient elution HPLC.[Method]Analysis was performed on a C18 column （ 4.6 mm×250 mm，5 μm） with acetonitrile and 0.2% phosphoric acid solution as mobile phase under gradient elution at a flow rate of 1.0 mL/min in 30 ℃ condition.The determination wave length was 254 nm.Retention time，peak purity test and spectrum similar test were used.[Result]Under the chromatographic conditions，albendazole，triclabendazole，levamisole hydrochloride and diclazuril were well separated.Albendazole，triclabendazole，levamisole hydrochloride and diclazuril had good linearity at 10-200 μg/mL，the average recoveries were 98.6%，99.5%，100.3%，and 99.1%，respectively，and RSD were 1.2%，1.0%，1.4%，0.8%，respectively.[Conclusion]The method developed by the research is simple，accurate and reliable，and can be used for simultaneously determining the content of the above four anthelmintic drugs.

Key words Albendazole;Trichlorobenzole;Levamisole hydrochloride;Diclazuril;Content determination;Gradient elution HPLC

作者简介 吴昊（1970—），男，安徽宿州人，高级兽医师，硕士，从事兽药、饲料、畜产品安全检测工作。*通信作者，高级兽医师，硕士，从事兽药检测技术研究。

收稿日期 2019-04-11

阿苯达唑是一种咪唑衍生物类广谱驱肠虫药物，作为高效低毒的广谱驱虫药，临床可用于驱蛔虫、蛲虫、绦虫、鞭虫、钩虫、粪圆线虫等。三氯苯达唑为新型咪唑类驱虫药，对各种日龄的肝片形吸虫均有明显驱杀效果，对牛、绵羊、山羊等反刍动物肝片吸虫，牛大片形吸虫、鹿肝片吸虫、鹿大片形吸虫、马肝片吸虫等均有效。盐酸左旋咪唑为四咪唑的左旋体，且药物对虫体的微管结构可能有抑制作用。盐酸左旋咪唑还有免疫调节和免疫兴奋功能，对蛔虫、钩虫、蛲虫和粪类圆线虫病有较好疗效。地克珠利属三嗪苯乙腈化合物，为新型、高效、低毒抗球虫药，广泛用于鸡球虫病[1-5]。

由于集约化养殖业的发展，由寄生虫引起的畜禽疾病时常发生，不仅影响猪、羊、牛、鸡等畜禽的健康成长，也影响养殖效益。为有效防治寄生虫病，定期驱虫、杀虫便成了养殖者的重要管理工作之一。目前，阿苯达唑、盐酸左旋咪唑采用高氯酸滴定法，三氯苯达唑采用紫外分光光度法，地克珠利采用高效液相色谱法[6-10]。实验室环境因素对高氯酸滴定结果影响较大，紫外分光光度法的定性效果不好。但对阿苯达唑等4种驱虫类药物的同时测定的研究鲜见报道。笔者对4种驱虫类药物的含量测定的液相方法进行研究，并对该试验方法进行验证。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试材。阿苯达唑片（规格0.1 g）、三氯苯达唑片（规格0.1 g）、盐酸左旋咪唑片（规格50 mg）、地克珠利预混剂（规格0.5%），上述样品均由安徽省某企业提供。

1.1.2 试剂。乙腈为色谱纯，Merck KGaA公司;其余试剂均为分析纯;试验用水为milli-Q超纯水。阿苯达唑对照品，来源于中国食品药品检定研究院，批号100373-201103，含量99.9%;三氯苯达唑对照品，来源于中国兽医药品监察所，批号H0421108，含量99.8%;盐酸左旋咪唑对照品，来源于中国食品药品检定研究院，批号100167-201203，含量99.8%;地克珠利对照品，来源于中国兽医药品监察所，批号H0131605，含量99.8%。

1.1.3 仪器。U3000戴安高效液相色谱仪，配戴安二极管阵列检测器，美国热电公司;BT-125D 电子天平，赛多利斯;KQ-500E型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件。色谱柱：Waters XSelect CSH C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相A为乙腈，流动相B为0.2%磷酸溶液，按表1程序进行梯度洗脱;流速1.0 mL/min;柱温30 ℃;扫描波长190～400 nm，记录254 nm的色谱图;进样量10 μL。

1.2.2 对照品储备液的制备。精密称取阿苯达唑对照品25 mg，置50 mL容量瓶中，加2 mL冰醋酸溶液溶解，用流动相定容至刻度，作为对照品储备液;精密称取三氯苯达唑、盐酸左旋咪唑对照品50 mg，置50 mL容量瓶中，用流动相溶解定容至刻度，分别作为三氯苯达唑、盐酸左旋咪唑对照品储备液。精密称取地克珠利对照品100 mg，置50 mL容量瓶中，用N-N二甲基甲酰胺溶解定容至刻度，作为地克珠利对照品储备液。

1.2.3 混合对照品溶液及系统适应性溶液的制备。分别精密量取阿苯达唑、三氯苯达唑、盐酸左旋咪唑、地克珠利对照品储备液各5 mL置50 mL容量瓶中，用流动相稀释定容至刻度，即得。

1.2.4 供试品溶液的制备。

1.2.4.1 阿苯达唑片供试品溶液的制备。取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于阿苯达唑25 mg），置 50 mL容量瓶中，加冰醋酸溶液10 mL，超声使溶解，放冷，用流动相稀释并定容至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 mL置50 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得阿苯达唑片供试品溶液。

1.2.4.2 三氯苯达唑片供试品溶液的制备。取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于三氯苯达唑25 mg），置50 mL容量瓶中，用流动相溶解稀释并定容至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 mL置 50 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得三氯苯达唑片供试品溶液。

1.2.4.3 盐酸左旋咪唑片供试品溶液的制备。取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于盐酸左旋咪唑50 mg），置 50 mL容量瓶中，用流动相溶解稀释并定容至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 mL置50 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得盐酸左旋咪唑片供试品溶液。

1.2.4.4 地克珠利预混剂供试品溶液的制备。取本品适量，精密称定，加N-N二甲基甲酰胺溶解并定量稀释成每1 mL中约含0.1 mg溶液，即得地克珠利预混剂供试品溶液。

1.2.5 方法学考察。

1.2.5.1 线性范围。精密量取“1.2.2”的对照品储备液适量，置于同一50 mL容量瓶中，用流动相配制含阿苯达唑质量浓度分别为10、20、50、100、200 μg/mL，三氯苯达唑质量浓度分别为10、20、50、100、200 μg/mL，盐酸左旋咪唑质量浓度分别为10、20、50、100、200 μg/mL，地克珠利质量浓度分别为10、20、50、100、200 μg/mL。分别精密吸取上述系列溶液进样10 μL，记录色谱图，测定峰面积;以对照品浓度（X，μg/mL）为横坐标、色谱峰峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程。

1.2.5.2 精密度试验。精密吸取混合对照品溶液10 μL，按“1.2.1”色谱条件，连续重复进样6次，记录峰面积，并计算RSD。

1.2.5.3 稳定性试验。取阿苯达唑片供试品溶液、三氯苯达唑片供试品溶液、盐酸左旋咪唑片供试品溶液、地克珠利预混剂供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h进样10 μL，记录色谱峰面积，并计算RSD。

1.2.5.4 重复性试验。取阿苯达唑片、三氯苯达唑片、盐酸左旋咪唑片、地克珠利4种驱虫类药物，按照“1.2.4”方法制备供试品溶液各6份，按“1.2.1”色谱分析条件，进样量为10 μL，测定峰面积，计算RSD。

1.2.5.5 加样回收率试验。精密称取已知含量的阿苯达唑片（规格0.1 g，含量为标示量的105.4%）约相当于阿苯达唑20 mg，共9份，置50 mL容量瓶中;精密称取已知含量的三氯苯达唑片（规格0.1 g，含量为标示量的100.4%）约相当于三氯苯达唑20 mg，共9份，置50 mL容量瓶中;精密称取已知含量的盐酸左旋咪唑片（規格0.1 g，含量为标示量的98.9%）约相当于盐酸左旋咪唑20 mg，共9份，置50 mL容量瓶中;精密称取已知含量的地克珠利预混剂（规格0.5%，含量为标示量的101.5%）约相当于地克珠利80 mg，共9份，置50 mL容量瓶中。按高（120%）、中（100%）和低（80%）3个浓度水平分别添加阿苯达唑、三氯苯达唑、盐酸左旋咪唑、地克珠利对照品，每个浓度水平的添加样品分别制备3份，按照“1.2.4”方法制备供试品溶液，再按“1.2.1”色谱条件测定，进样量为10 μL，测定峰面积，计算平均回收率和RSD。

1.2.6 样品含量测定。取阿苯达唑片、三氯苯达唑片、盐酸左旋咪唑片、地克珠利预混剂各4批，一式2份，按“1.2.4”方法制备供试品溶液，按“1.2.1”色谱条件进行测定，计算样品中阿苯达唑、三氯苯达唑、盐酸左旋咪唑、地克珠利的含量。

2 结果与分析

2.1 系统适用性试验  4种驱虫类药物在“1.2.1”色谱条件下完全分离，分离度均大于2.1，各化合物的色谱峰理论塔板数均大于7 000，方法专属性良好。相应对照品色谱图、系统适应性溶液色谱图及空白试验色谱图见图1～3。

2.2 线性范围 按照“1.2.5.1”方法操作，从表2可以看出，阿苯达唑、三氯苯达唑、盐酸左旋咪唑、地克珠利浓度均在10～200 μg/mL与峰面积呈良好的线性关系。

2.3 精密度试验 按照“1.2.5.2”方法操作，计算得出阿苯达唑、三氯苯达唑、盐酸左旋咪唑、地克珠利的峰面积的RSD均为0.1%，表明仪器精密度良好。

2.4 稳定性试验 按照“1.2.5.3”方法操作，计算得出阿苯达唑、三氯苯达唑、盐酸左旋咪唑、地克珠利的峰面积的RSD分别为0.5%、0.3%、0.4%、0.3%，表明上述4种驱虫类药物的供试品溶液在室温下放置24 h稳定。

2.5 重复性试验 按照“1.2.5.4”方法操作，测得阿苯达唑的含量均值为标示量的105.4%，RSD为0.6%（n=6）;三氯苯达唑的含量均值为标示量的100.4%，RSD为0.7%（n=6）;盐酸左旋咪唑的含量均值为占标示量的98.9%，RSD为0.8%（n=6）;地克珠利的含量均值为标示量的101.5%，RSD为0.3%（n=6），表明方法重复性良好。

2.6 加样回收率试验 按照“1.2.5.5”方法操作，结果发现阿苯达唑、三氯苯达唑、吡喹酮、地克珠利平均回收率（n=9）分别为98.6%、99.5%、100.3%、99.1%，RSD分别为1.2%、1.0%、1.4%、0.8%，表明方法的准确度较好。

3 讨论与结论

分别考察了甲醇-0.2%磷酸溶液、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.2%磷酸水和乙腈-0.1%甲酸水4种流动相体系，结果表明，乙腈-0.2%磷酸水流动相体系分离效果最佳。因此该研究采用乙腈-0.2%磷酸水作为流动相进行梯度洗脱（0～5 min，20%乙腈→80%乙腈;5～10 min，80%乙腈;10～15 min，80%乙腈→20%乙腈）。

在波长选择上，采用DAD检测器对阿苯达唑、三氯苯达唑、盐酸左旋咪唑、地克珠利4种驱虫类药物进行光谱扫描，结果显示，在254 nm的波长下，这4种驱虫类药物均有良好的响应值。因此采用254 nm作为该方法的检测波长。

该研究建立的梯度洗脱同时测定阿苯达唑、三氯苯达唑、盐酸左旋咪唑、地克珠利的含量的分析方法，结果表明该方法稳定性好、专属性强、准确度高，提高了工作效率，降低了试验误差。

参考文献

[1] 王新，李艳华.兽医药理学[M].北京：中国农业科学技术出版社，2006：137.

[2] 角田清.鸡球虫病学[M].上海：上海科技出版社，1986：87-91.

[3] 黄兵，董辉，沈杰，等.中国家畜家禽球虫种类概述[J].中国预防兽医学报，2004，26（4）：313-316.

[4] 常晓辉，薛飞群，张丽芳.鸡球虫病药物防治的研究现状[J].中国动物传染病学报，2011，19（5）：71-75.

[5] 高明燕，劉爱玲，刘桂兰，等.抗球虫病药物的研究进展[J].安徽农业科学，2013，41（4）：6308-6311.

[6] 中国兽药典委员会.兽药质量标准（2017年版）：化学药品卷[S].北京：中国农业出版社，2017.

[7] 中国兽药典委员会.兽药质量标准（2017年版）：中药卷[S].北京：中国农业出版社，2017.

[8] 中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典（2015年版一部）[S].北京：中国农业出版社，2017.

[9] 邵超.HPLC法测定阿苯达唑颗粒的含量[J].黑龙江医药，2011，24（3）：341-342.

[10] 赵英，张平，唐文标，等.高效液相色谱法测定兽用阿苯达唑片的含量[J].中国兽药杂志，2004，38（5）：33-34，37.