利用微生物技术修复污染土壤的方法

夏明 万何平 曹新华 孙齐英 周世力

摘要 土壤是人类赖以生存的重要资源，随着工农业生产的快速发展，土壤污染已成为全球性的重要环境问题。微生物修复技术具有其他土壤修复技术手段无法比拟的优势，已成为土壤修复领域研究的前沿之一。介绍了原位微生物修复技术和异位微生物修复技术的主要应用类型，对近年来国内外在固定微生物技术、微生物和植物联合修复技术、高效基因工程菌开发等方面的研究进展进行了综述，并对今后微生物修复技术的发展趋势和应用前景进行了展望。

关键词 微生物;土壤修复;固定微生物技术;微生物和植物联合修复技术

中图分类号 X53 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2020）14-0013-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.14.004

Abstract Soil is an important resource for human survival. Due to the rapid development of industrial and agricultural activities， soil pollution has become one of the biggest global environmental challenges. Microbiological repair technology， having an advantage over other technical means， has become one of the frontiers in soil restoration research. Here we gave an overview of in situ and ex situ bioremediation， and their main application types. In addition， we reviewed the recent progress of research on the immobilized microorganism technology， the microbe-plant combined remediation technology， and the development of efficient gene engineering bacteria. The future development trends and application prospects of the microbial remediation technology were prospected.

Key words Microorganism;Soil remediation;Immobilized microorganism technology;Microbe-plant combined remediation technology

随着人口的迅速增长和经济的快速发展，为了维持和改善生活质量，人类需要更多的染料、杀虫剂以及各种药物等，尽管这些化学物质中很多都可以被利用或者被降解，但仍然有很多被释放到空气、水体和土壤中，我国的土壤污染问题也愈加凸显出来。工业化快速发展及随之产生的工业“三废”的大量排放，城市污染的加剧和农业生产中使用化肥、农药的增加，导致土壤生态环境质量日益恶化，对人类的粮食安全、生存环境及健康构成了严重威胁[1]。

土壤污染主要是由工厂活动产生的废物、农业使用的化学物质以及生活废物处置不当引起的。常见的化学物质包含石油烃、多环芳烃、农药、铅和其他重金属元素[2]。直接与已被污染的土壤接触和由于污染土壤中或土壤下的供应水引起的二次污染都可能对人类健康造成威胁[3]。据统计，全国2014年土壤污染总超标率为16.1%，土壤一旦受到污染，将会进一步污染地下水体等自然生态系统的稳定[4]，甚至影响到粮食和农副产品的质量，且其治理和恢复难度相当大（环境保护部）[5]。全面调查已被污染的土壤区域以及随后对其实施净化措施涉及的领域非常多，有地质学、水文学、化学、电脑建模等，还需要充分了解工业化学的发展史，是一项极费时和费钱的工程[6]。

对于污染土壤的修复，传统的治理方法有物理修复法和化学修复法，但是通过这2种方法来降低土壤中污染物浓度投资大，且不易操作，不适合大范围推广应用。化学修复法主要通过使用化学修复剂，使之与土壤中的污染物质发生氧化反应、还原反应、吸附反应、沉淀反应和络合反应等，达到将土壤中的污染物质分离、降解或转化成无毒或低毒的形式去除，但去除污染物的同时可能会将化学成分引入到土壤中，从而造成二次污染的环境风险。微生物修复技术是指利用天然存在的土著微生物群、外源微生物群以及采用遺传工程手段研究和构建的高效降解菌株或人工开发的基因工程菌，适宜的环境条件会加强微生物的代谢作用，从而达到降低土壤中有毒有害污染物活性，或直接使其降解成为无毒物质的目的。微生物个体小，比表面积大;吸收多，转化快;生长旺，繁殖快;适应强，易变异;分布广，种类多，同时，微生物营养类型多样，大体可以分为四大类型：光能无机营养型、光能有机营养型、化能无机营养型和化能有机营养型，可以利用多种物质作为能量来源。微生物修复技术具有其他技术手段无法比拟的优势，已成为该领域研究的前沿之一[3]。

1 土壤微生物简介

土壤是微生物的大本营，是微生物生长和繁殖的天然培养基。土壤中微生物具有以下特点：类群丰富，一般包含细菌、放线菌、真菌、藻类和原生动物五大类;数量繁多，一般来说，在每克耕作层土壤中，细菌数量约为108个，放线菌（孢子）数量约为107个，真菌（孢子）数量约为106个，酵母菌数量约为105个，藻类数量约为104个，原生动物约为103个;分布广泛，由于土壤质地、发育历史、发育母质、季节、肥力、作物种植状况、土壤层次和深度等不同，其所含的微生物种类和数量会表现出很大差异，一般在微生物修复过程中起作用最大的是细菌，其次是放线菌和真菌类。土壤微生物可以通过固氮、降解无机磷钾等改善土壤的物理、化学结构并提高肥力，又可促进植物光合效应、抑制植物病原菌增殖、促进作物生长，还可降解多种重金属离子实现对污染土壤的修复[5]。

2 污染土壤的微生物修复技术

20世纪70年代以来，随着微生物处理技术在石油及重金属污染治理等方面的广泛应用[7]，在利用微生物来降解有机污染物和重金属污染土壤的修复等方面取得了较好的效果，该法逐渐取代传统的化学修复法和物理修复法而成为修复污染土壤的核心技术。从不同的角度，可以对土壤污染修复技术进行不同分类，其中按修复土壤的位置可以将微生物修复技术分为原位修复技术和异位修复技术。

2.1 原位微生物修复技术

原位的意思是指微生物修复发生的地理位置就在受污染的位置，所以原位微生物修复是指不移动受污染的土壤或污染物，而是通过直接在其中添加微生物试剂、营养元素等，以提高土著微生物或外源微生物对土壤有机污染物的降解作用，直接在发生污染的场地对其进行原地修复作用。原位微生物修复技术现已广泛应用于含有碳氢化合物、氯化物、硝酸盐、有毒金属和其他化学反应产生的污染物质的生物修复过程中。原位修复技术主要有生物培养法、投菌法和生物通风处理法等方法。

2.1.1 生物培养法（bioculture）。

生物培养法利用的是受污染土壤中的土著微生物，这一类微生物有的可以降解土壤中的有机污染物，故而可以定期向土壤中投加适合且促进土著微生物生长繁殖所需的营养物作为能源，同时添加氧和过氧化氢作为其正常代谢过程中所需的氢受体（电子受体），在这种适宜条件下，土著微生物可以正常甚至加速新陈代谢和生长繁殖，整个过程中可以将土壤中的污染物转化为代谢产物或直接降解成二氧化碳和水[8]。此法修复污染土壤的缺点是一般需要时间较长。

2.1.2 投菌法（bioaugmentation）。

如果土壤中的土著微生物无法降解该环境中的污染物质，那么可以采取向该环境中引入外源物种以达到加速降解土壤中污染物质的目的。此法中一般需要加入多种微生物：地衣杆菌（ B.licheniformis）、苏云金芽孢杆菌（B.thuringiensis）、多粘菌（P.polymyxa）、嗜热脂肪芽孢杆菌（B.stearothermophilus）、青霉菌（Penicillium sp.）、曲霉（ Aspergillus sp.）、黄杆菌（ Flavobacterium）、节杆菌（Arthrobacter）、假单胞菌（Pseudomonas）、链霉菌（Streptomyces）和酵母菌（Saccharomyces） 等，同时还需要提供这些微生物生长所需要的营养物，包括N、P、K、S、Ca、Mg、Fe、Mn等，其中N和P是微生物主要的营养元素[9]。有研究表明，在向污染了石油烃的土壤中定期投入混有马红球菌、假单胞菌和鞘氨醇单胞菌的混合菌群6个月后，石油烃的去除率达54%。

2.1.3 生物通风处理法（bioventing）。

生物通风法主要用于地下水系统中有机污染物的生物降解，也常用于由地下油管泄漏造成的轻度污染土壤的生物修复，该法在提高土著微生物活性的同时还可以通过在通气层中通入空气或氧气以促进原位生物降解能力。在受污染的土壤中，由于微生物生长繁殖与新陈代谢过程使得其中氧气浓度降低，能够发挥降解污染物的微生物生命活动被抑制，从而大大降低土壤中污染物的降解效果，此时向该土壤中通入空气或氧气，可以恢复土著微生物的活性，从而继续达到降解污染物的目的[8]。

2.2 异位微生物修复技术

利用异位微生物修复技术处理污染土壤時，要求将被污染的土壤挖出，搬动或输送到它处集中起来进行生物修复处理[10]，具有高效且便于监控的特点，但是由于运输和后期处理过程中存在扩散的可能，所以该法也存在一定的局限性，一般用来处理污染浓度高且污染土壤量不大的区域。异位微生物修复既可以在土壤受污染之初进行处理，又可以通过过程控制器或生物反应器产生有利于生物降解的条件。主要方法有土耕法、生物堆制法、土壤堆肥法、生物泥浆法和预制床法。

2.2.1 土耕法（land farming）。

土耕法是将被污染的土壤或沉积物挖出转移至土耕位点并放置于处理垫上，以防止污染物转移，并进行定期翻动以达到往被污染土壤中补充空气使上部处理带保持好氧状态，该法往往还会利用黏土来阻挡露出的污染物以防止地下水污染。土耕法费用极低，时间短，通常60～80 d即可，因此可以在多种污染土壤的生物修复过程中使用，但是其无法处理挥发性有机物，因而会让这一部分有机物进入大气造成空气污染。

2.2.2 生物堆制法（biopile）。

生物堆制法是土耕法的改进形式，是一种将受污染的土壤从污染地区挖掘出来，运送到指定地点（提前布置了防止渗漏衬底、通风管道等）进行生物降解的异位修复技术[11]。这种方法包括将受污染的土壤进行堆放，依靠通风、加入营养物质和微量元素以及增加湿度等手段，模拟土壤中的好氧微生物降解过程以去除土壤中吸附的污染物组分[11]。生物堆制处理技术设计和安装简单，修复需要的时间短，但是此方法占地面积较大，若土壤中存在一定浓度的重金属，可能会抑制生物降解。

2.2.3 土壤堆肥法（composting）。

土壤堆肥法是一种在有氧条件下降解土壤有机污染物的微生物修复方法，且经过修复后的有机物质可以重复利用。与土耕法不同的是，土壤堆肥法还需要额外加入土壤调理剂，土壤调理剂主要包括稻草、粪便等，基本需要含有以下4种营养物质：碳作为能源物质;氮用来维持微生物的生长代谢，同时有助于其产生能氧化碳的有机物质;氧也可以氧化碳从而加快降解污染物的速度;水用来保持微生物活性，且有利于维持有氧环境。与土耕法或生物堆制法相比，土壤堆肥法虽然处理费用略高一点，但可以降低污染土壤的修复时间，且其对去除含高浓度不稳定固体的有机复合物的效率最高。

2.2.4 生物泥漿法（bioslurry treatment）。

生物泥浆法实质是一种生物反应器，将受污染的土壤挖出，去除其中的石块和碎石之后，与水混合后置于一个容器中（典型的泥浆中会包含10%～30%的固体），随后加入营养物质以增强微生物降解污染物质的能力，整个过程中可以通过控制温度、混合强度和营养物质达到降解最大化。处理后的污染土壤干燥后经过检测确保污染物质已被完全降解后即可再运回原地，经过改良后更可实现可移动化。生物泥浆法已被广泛用于被三硝基甲苯（TNT）污染土壤的生物修复中。

2.2.5 预制床法（prepared bed）。

预制床法是首先在防止渗漏的平台铺上石子和沙子，按10～30 cm的厚度平铺在处理垫上，以防止污染物转移，并在表面洒上营养物质和水，同时进行定期翻动，以使受污染土壤与空气和营养物（有机营养物和无机营养物）充分接触，满足微生物生长的需要，处理过程中流出的液体可淋回土壤上，这样可以使得原土壤中的污染物得到彻底有效降解[8]。但该方法存在着操作复杂且成本较高的问题。

3 微生物修复的发展趋势

3.1 固定化微生物技术

固定化微生物技术是20世纪60年代在固定化酶技术基础上发展起来的一种生物修复技术，它是利用化学或物理手段将游离的微生物或酶与特定的载体结合，固定于限定的空间区域，以提高微生物细胞或酶的浓度，使其保持较高的生物活性并可反复利用的方法[7，12]。固定化微生物技术主要包括包埋法、吸附法、包络法、共价结合法以及交联法，它们都是将微生物固定在一个限定空间内，只是固定的原理各不相同。包埋法是指将微生物包裹在凝胶格子或聚合物半透膜微胶囊中，吸附法是依据细胞表面与载体表面之间的静电、表面张力和粘附力，使细胞固定在载体上;包络法是利用载体材料的多孔性让微生物在其表面生成机械强度较高的生物膜，同时微生物还会在材料的内孔处形成高密度的群落;共价结合法是利用细胞表面与载体表面形成化学共价键从而固定微生物的方法;交联法是利用微生物菌体相互之间连接形成网状结构从而达到固定的方法。目前，固定化微生物技术已成为环境科学、生命科学及其相关学科的研究重点[13]。

3.2 微生物和植物联合修复技术

微生物和植物联合修复是通过形成土壤-植物-微生物的复合体系来共同降解污染物，从而清除环境污染物，提高污染土壤的修复效率[14]。在这个复合体系中，植物根系可以给微生物提供生活场所，而微生物生长可以促进降解土壤中的污染物，从而促使植物更好的生长[14]，提高植物耐受性，最终通过这种互助作用修复污染土壤[15]。目前，对于微生物和植物联合修复技术主要应用在两个方面[16-17]：①改善和提高土壤重金属污染的修复效果;②在农药污染土壤修复领域广泛应用。近年来，利用植物-微生物联合修复取代单一的微生物修复或单一的植物修复，已成为农药污染土壤修复领域的研究热点。

3.3 高效基因工程菌的开发

利用微生物降解污染土壤中的污染物已经得到广泛应用，但由于污染物种类繁多，尤其是难降解的污染物的存在很大程度上增大了修复难度，延长了修复周期，阻碍了生物修复技术的进一步应用。通过基因工程的手段构建高效环境工程菌可以明显提高微生物对土壤污染物的降解效率[18]。Plotnikova等[19]成功将一株多环芳烃降解菌（假单胞菌SN11）中的多环芳烃降解质粒转移到嗜盐性恶臭假单胞菌BS394中，构建出的基因工程菌可以在高盐浓度的污染土壤中存活且仍具有较高的多环芳烃类化合物降解能力。

4 展望

生物修复污染土壤具有高效且低成本的特点，其中微生物修复技术更具有降低健康风险、提高生物多样性以及在天然环境下修复污染生态系统的优势，在土壤污染的修复实践中有广阔的前景和巨大的潜能[20]。虽然已有很多实例证明利用微生物可以降解大部分土壤中的污染物，但是该技术的大规模应用还需要继续深入研究，今后可以重点从以下方面进行突破：①由于大量环境因子对生物修复速率和程度的影响还未研究透彻，导致在使用过程中有很多不确定性，同时，目前很多的野外试验设计并不合理科学，且缺少条件控制、分析不够合理，未来研究过程中试验设计和数据质量还有待提高，需要从多角度分析微生物修复技术的机理和工艺流程;②有关微生物及其在环境中的地位不同会对其应用产生影响，所以还需要进一步探索具有降解污染物功能的微生物多样性，探究各类微生物的生理特性，合理运用于对特定污染物的降解;③现有的微生物菌种以及通过各种基因工程改良的菌种已成功运用于多类污染土壤的生物修复过程中，但是还有多种污染物质无法得到有效降解，需要探寻可以适应更多环境的，尤其是寻找和开发极端环境微生物，以适应于不同土壤环境的污染物降解，同时需要继续筛选、驯化新的高效降解微生物菌种，开发高效降解基因工程菌;④生物修复涉及的生物种类繁多，不同种类的生物也有其不同的应用条件，且不同方法之间交叉使用可以达到事半功倍的效果，所以还需要将微生物修复技术与植物修复技术、电动修复技术、化学钝化技术、微生物吸附技术等相结合，从而提高修复效果，降低应用成本，增加修复的经济效益。

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