基因技术在大豆抗病虫害育种上的应用研究

付海涛

1大豆遗传转化技术的应用

1.1基因枪法

基因枪法，亦称为微弹轰击法，具体应用流程如下所示：首先，让DNA粘附在钨粉或者金粉粒子，即微载体的表层，其后，将高压放电或者气体作为驱动力，最后，将金属微粒导入目标植被细胞之中，以实现遗传转化。这一基因转移技术最早由美国学者Sanford等研究者提出，其后在1988年，Mcca等研究者利用基因枪法射击大豆胚芽的生长点，诱引不定芽出现并形成完整的大豆植株，最终获取了转基因大豆。基因枪法主要的转化受体对象为幼胚的轴杆、尖端、悬浮细胞和未成熟的胚芽茎杆尖端，其后应用潮霉素选择转化植株。

基因枪法的应用优势在于：第一，不会受到基因组织类型的影响；第二，遗传转化率较高；第三，能够有效转移重组的完整DNA或者DNA片段。而该技术的缺陷在于相较于农杆菌介导法，其所需消耗的成本更高，而且技术操作难度较大，同时由于基因拷贝数量较多，极易导致基因沉默现象的出现。

1.2农杆菌介导法

土壤中最为常见的革兰氏阴性菌就是农杆菌，其可在自然环境下自发性地感染绝大部分的双子叶植被的损伤部位，并诱发植被生成发状根或者冠瘿瘤。农杆菌通过诱引根质粒（Ri）或者瘤细胞质粒（Ti），将其中一部分特殊的DNA片段导入寄主细胞的基因组中，以此来实现寄主细胞的转变。农杆菌介导法的作用原理在于应用分子克隆技术在Ri或者Ti质粒的T-DNA区域内添加拟转基因，借助农杆菌的感染作用将携带的T-DNA插入植被细胞，同时将拟转基因添入至植被基因组，以此来引发相应的植被细胞遗传的转化。现阶段，研究人员已研发了多种能应用于转化植被基因的农杆菌Ti质粒装载系统。

Hinchee等研究者首先通过应用农杆菌介导法获取了大豆转基因植株，其后，转基因大豆成绩斐然，而农杆菌介导法也成了实现转换大豆遗传的重要方式之一。下面，笔者将列举几个应用农杆菌介导法实现大豆遗传转化的成功案例，具体如下所示：其一，Parrot等研究者应用农杆菌介导法浸染大豆尚未成熟的子叶，并得到了大豆转基因植株；其二，王慧中等研究者利用农杆菌介导法浸染大豆顶端胚芽，筛选出抗性愈伤部位，最终获得了抗性芽，通过生化检测可知胚芽包含冠瘿碱；其三，徐香玲等研究者利用农杆菌Ti质粒装载系统，成功将内毒素基因导入东北大豆黑龙37和39等多个品种，其后诱导其发芽成型，通过选择检测可知，内毒素基因已成功整合至大豆基因组之中。

农杆菌介导法的应用成功率会受到T-DNA转化效率、大豆基因组类型、植被培养条件、农杆菌感染性以及筛选形式等诸多因素的影响，因而如何进一步提升农杆菌介导法的遗传转换效率就成了未来研究工作的主要方向。

1.3花粉管通道法

该技术手段的应用原理为：将含有目标基因的DNA放置于刚完成授粉并已切割的花柱之上，其后DNA就会顺着花粉管抵达胚珠，进而将其插入至胚珠基因组之中，当带有外来基因的受精卵生长发育成成熟植株时，就可获取转基因植株。应用花粉管通道法插入外来基因的手法主要有柱头滴加法、子房微注射法、生殖细胞浸染法以及花粉粒外携法等等。这一方法首先应用于水稻的遗传转化，其后扩展到其它农作物。雷勃均等人是最早应用花粉管通道法实现大豆遗传转化的研究者，其后众多研究人员也相继进行了这一领域的研究，并成功培育出了抗病大豆品种，如刘博林等研究者就应用了子房微注射法，将龙葵的Atrazine基因导入至大豆之中，借助涂抹和杂交等手段，最终获取了大豆转基因植株。虽然花粉管通道法操作较为简单，但研究人员也需对外来基因射入时间、方式以及后代筛选等问题进行进一步地探究。

2大豆抗病毒基因的应用

2.1Bt晶体蛋白毒素基因

Bacillus Thuringiensis，简称为Bt，中文学名为苏云金杆菌，一般称之为杀虫结晶蛋白。Bt晶体蛋白毒素基因在多种农作物的病虫害防治上有着较强的毒杀功用，同时其对人类、畜牧以及害虫的天敌则无毒性，是现阶段在转基因抗病虫害和育种领域应用较为成熟的一种基因。1977年，徐香玲等研究者借助农杆菌介导法，成功将PKT54B7C5中的Bt-K8晶体蛋白毒素基因射入东北大豆黑农37和39等多个品种之中，并获取了再生大豆植株，经过SOurthen和PCR的杂交测试可知，Bt-K8晶体蛋白毒素基因已成功整合至大豆基因组之中。2011年，李希臣等研究者利用农杆菌介导法成功将Bt（crylA）晶体蛋白毒素基因导入大豆。

2.2大豆病毒外壳蛋白基因

現阶段，研究者将克隆完成的大豆病毒外壳蛋白基因，即TMY-导入植被体内发现，植株出现了一定程度的抗性。施树良等研究者利用质粒介导土豆病毒外壳蛋白基因实以及输导烟草病毒外壳蛋白基因，两者方式均实现了大豆遗传的转化并获取了大豆再生植株。1996年， 李兴华等研究者应用包含质粒的大豆花叶病毒外壳蛋白基因，即发根农杆菌浸染大豆品种，最终获取了转化大豆植株，从而为大豆抗病虫害育种提供了全新的研究思路。

2.3CpTi基因

CpTi，即植物蛋白酶抑制剂，其是一种天然的抗病虫害物质。通过应用物蛋白酶抑制剂，使得害虫在进食后难以实现营养物质的消化和吸收，最终导致害虫的死亡。相较于Bt晶体蛋白毒素基因，物蛋白酶抑制剂具有应用范围广且不易生成抗药性等优势，其中，1994年，Parrot等研究者已成功将物蛋白酶抑制剂导入大豆之中。

综上所述，大豆遗传转化技术、大豆抗病毒基因的应用，相信在先进技术支持下，大豆抗病虫害能力将大幅度提升，其育种效果将更加显著。

（作者单位：164135 沈阳联勤保障中心龙镇农副业基地）