TGEV和PEDV的多重PCR方法在猪传染性胃肠炎病毒检测中的应用研究

黄红

（黑龙江省畜牧研究所，黑龙江 齐齐哈尔 161005）

摘要：目的：通过应用同时检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）的多重RT-PCR 方法，并对其进行特异性与敏感性试验。方法：对本地区150份临床疑似病毒性腹泻病料进行检测，检测了仔猪腹泻的粪便或小肠组织共150份病料。在实验室检测中，此方法能检测约50 TCID50的混合病毒，能够扩增出3条长度为750 bp（PEDV）、544 bp（TGEV）、275 bp（PARV）特异性片段，而其它病毒无特异性条带。结果：PEDV、TGEV阳性率分别为54.67%（82/150）、8.0%（12/150）。PEDV 与TGEV 混合感染率为5.33%。结论：同时检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）的多重RT-PCR 方法的应用对临床上进行这两种疾病混合感染的检测具有重要意义。

关键词：猪流行性腹泻病毒；TGEV；PEDV；PCR检测

猪是唯一自然感染的动物，任何年龄猪只皆会感染发病，此病是通过粪口途径传播，好发于湿冷的天气，尤其是冬春、秋冬季节交换之际。感染猪临床上以呕吐、水样下痢及脱水为主征，造成出生仔猪高死亡率[1]，死亡率可高达100%。猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）属于冠状病毒科（Coronaviridae）中的冠状病毒属（Corona virus），为具封套的正股单链RNA 病毒[2]。将其感染PD5 细胞株，以acridine orange 或propidium iodide 染剂将细胞核染色后，于荧光显微镜下观察可见染色质密度增加并有凋亡小体的产生[3]。经电泳分析可见其DNA 阶梯状的现象，另以扫描式电子显微镜也可见到细胞表面泡状化及凋亡小体的产生[4]。猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）和目前引起人类非典型肺炎的严重急性呼吸道症候群（Severe acute respiratory syndrome，SARS）同属冠状病毒科（Coronaviridae）中的冠状病毒属（Coronavirus）。细胞凋亡对多细胞生物个体发育、正常细胞更新、各组织保持正常结构与功能有着积极而重要的意义。[5]而研究细胞凋亡的基因表达与调控及其信息传递机制，对基础细胞生物学、生物医学及某些疾病的诊断和治疗都将产生深远影响，故有关细胞凋亡测试方法的研究也成为当今国内外研究的新热点，这也为细胞凋亡分析测试方法的研究提出了一个更加严峻的课题，这方面的研究有待继续深入[6]。

本实验对本地区150份临床疑似病毒性腹泻病料进行检测，检测了仔猪腹泻的粪便或小肠组织共150份病料，现报告如下。

1材料与方法

1.1病毒与病料

猪流行性腹泻病毒（PEDV）CV777 毒株、猪传染性胃肠炎（TGEV）JSXB2010 毒株，均由本实验室保存。

1.2检测方法

对本地区150份临床疑似病毒性腹泻病料进行检测，检测了仔猪腹泻的粪便或小肠组织共150份病料。在实验室检测中，此方法能检测约50 TCID50的混合病毒，能够扩增出3条长度为750 bp（PEDV）、544 bp（TGEV）、275 bp（PARV）特异性片段，而其它病毒无特异性条带。

2结果

2.1多重RT-PCR 的特异性

PEDV、TGEV阳性率分别为54.67%（82/150）、8.0%（12/150）。PEDV 与TGEV 混合感染率为5.33（8/150）。

2.2多重RT-PCR 的敏感性

将两种病毒混合后提取的RNA 全部反转录所得cDNA 按10倍比稀释，在确定的退火温度以及引物浓度下，其它条件不变，进行PCR 扩增。假定所提取的RNA 无降解，全部反转录，此多重RT-PCR 可检测到约50 TCID50的混合病毒量。

讨论：通过本实验结果显示，无论是在形态学上或生化学检测方面，都符合细胞凋亡的特征，证实猪传染性胃肠炎病毒于PD5 猪肾细胞株可诱发细胞凋亡的现象，且初步分析病毒感染后细胞的caspase 的活性，可见caspase-2，-3，-4，-6，-8，-9，-10活性皆有增加，显示本病毒可能通过细胞表面死亡受体的外在路径或通过粒线体调控的内在路径引发细胞凋亡[7]。目前已有研究证明多种病毒、细菌都可诱发细胞凋亡的机转，其中又以病毒最被广为研究，且亦多种病毒基因被证明与细胞凋亡有直接的关系，未来可通过更深入的研究以了解TGEV 诱发细胞凋亡的信息傳递路径及其分子机制，以供其它冠状病毒细胞凋亡分子模型的参考[8]。方法灵敏度与特异性高，尤其是对早期凋亡细胞的检测，但仍需配合细胞形态学的特征而加以判断。另通过扫描式电子显微镜的观察，也可明显见到细胞表面呈现泡状化的细胞，及由凋亡细胞脱落出凋亡小体的现象。本组资料显示，同时检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）的多重RT-PCR 方法的应用对临床上进行这两种疾病混合感染的检测具有重要意义。

参考文献：

[1]凌丁，张业怀. 农村仔猪腹泻病发病情况调查及防控措施[J]. 黑龙江畜牧兽医，2016，16：116-119.

[2]胡兴义，张双翔，金志强，等. 贵州地区仔猪病毒性腹泻流行病学调查[J]. 中国预防兽医学报，2016，07：542-545.

[3]熊年年，陶洁，张清真，等. 猪四种病毒性腹泻病原多重PCR检测方法的建立及应用[J]. 中国兽医科学，2016，08：972-978.

[4]宋林林，王晓红，姜博，等. 猪传染性胃肠炎病毒陕西分离株S蛋白抗原位点的真核表达[J]. 动物医学进展，2016，08：6-10.

[5]樊雅婷，张志，吴发兴，等. 猪传染性胃肠炎病毒流行株的分离鉴定及其S基因序列分析[J]. 黑龙江畜牧兽医，2015，21：32-35.

[6]滑翔，胡中凯，黄小波，等. 检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的cDNA芯片的构建[J]. 畜牧兽医学报，2015，12：2235-2242.

[7]Qian Zhang， Ruiming Hu，Xibiao Tang， Chenglong Wu，Qigai He， Zhanqin Zhao， Huanchun Chen， Bin Wu. Occurrence and investigation of enteric viral infections in pigs with diarrhea in China[J]. Archives of Virology. 2013（8）：98-99.

[8]H. B. ZHANG，L. HUANG，Y. J. LIU，T. LIN，C. Q. SUN，Y. DENG，Z. Z. WEI，A. K CHEUNG，J. X. LONG，S. S. YUAN. Porcine bocaviruses： genetic analysis and prevalence in Chinese swine population[J]. Epidemiology and Infection. 2013（10）：121-122.