鸡传染性法氏囊病毒新型变异株的分离鉴定

严专强 尹丽娟 刘琳琳 杨德鸿 梁晓颖 魏晓娜 黄建飞 周庆丰

摘  要：本研究通过病毒分离、RT-PCR和测序分析等方法，从广东某肉鸡场发生法氏囊和胸腺严重萎缩的鸡群中分离了1株传染性法氏囊病毒，命名为GD2020株。氨基酸序列分析结果显示，分离株VP2基因高变区与近期国内分离的法氏囊病毒新型变异株SHG115株同源性为99.1%，与早期变异株Variant E株同源性为97.5%，与经典毒株、超强毒株和弱毒株同源性在89.3%～94.1%之间。进化分析结果表明，GD2020株与SHG115株属于同一分支，与早期变异株和经典毒株亲缘关系较远。GD2020株感染不引起鸡只死亡和出现腿肌出血等典型临床症状，但能引起法氏囊严重萎缩。本研究为广东地区传染性法氏囊病的防控提供了数据支持。

关键词：传染性法氏囊病毒;新型变异株;分离鉴定;VP2基因

中图分类号：S858.31     文献标识码：B     文章编号：1673-1085（2020）7-0050-03

鸡传染性法氏囊病（Infectious bursal disease，IBD）是由IBD病毒（Infectious bursal disease，IBDV）引起的一種鸡的急性、高度接触传染性、溶淋巴细胞性的免疫抑制性传染病[1]。IBDV主要感染3～6周龄的青年鸡，感染后法氏囊先出现充血水肿，再严重萎缩，导致法氏囊中淋巴滤泡被大量破坏，引起鸡只急性发病甚至死亡[2]。IBDV属于双RNA病毒科禽双RNA病毒属， 有血清I型和血清II型， 仅血清I型对鸡有致病性。根据致病性和病毒中和试验可将血清I型IBDV分为经典株、变异株、超强毒株和弱毒株[1]。

免疫接种是控制IBD的主要方法。IBD疫苗种类繁多，包括全病毒灭活疫苗、亚单位疫苗、HVT载体疫苗、弱毒疫苗及抗原抗体复合物疫苗等。近年来，由于疫苗的合理使用，IBDV超强毒株在田间爆发频率逐渐降低。然而，哈尔滨兽医研究所近期的一项调查结果显示IBDV新型变异株开始在我国广泛流行，研究人员于2017～2019年间，从黑龙江、吉林、辽宁、河北、北京、山东、山西、福建、江苏、安徽、湖北、浙江和云南等13个省份的免疫鸡群中分离了82株新型变异毒株，这表明在用的IBDV疫苗可能不能保护新毒株的感染[3-4]。本研究对近期广东省分离的IBDV毒株进行了基因序列分析，以期为该病的有效防控提供参考数据。

1  材料与方法

1.1  临床样品采集与病毒分离  发病鸡群弱小鸡偏多，均匀度在80%以下，剖检可见法氏囊和胸腺严重萎缩。采集发病鸡的法氏囊和脾脏组织，剪碎，加入5倍量2000IU/mL的青霉素、链霉素研磨成糜状，移入灭菌离心管中，在4℃的冰箱中放置3h后，反复冻融3次，8000rpm离心5min，取上清经绒毛尿囊膜途径接种10～12日龄SPF鸡胚。孵化6d后，从人工气室端剥去卵壳，观察膜上有无增厚或痘斑病变，并收集活胚和48h后死胚的绒毛尿囊膜，研磨后-80℃备用。

IBDV超强毒株DH2017株由本实验室保存。使用10～12日龄SPF鸡胚测定新分离毒株和经典毒株效价。

1.2  RT-PCR检测  取1.1中收集的绒毛尿囊膜研磨液，离心后取上清，按照RNAiso Plus试剂盒说明书提取总RNA。

使用TaKaRa公司PrimeScript One-Step RT-PCR试剂盒进行VP2基因扩增（上游引物：5′-GCCGATGATTACCAATTCTCATC-3′;下游引物：5′-CCGGATTATGTCTTTGAAGC-3′），反应条件为： 50℃ 30min;94℃ 3min;94°C 40s，53°C 40s，72°C 40s，共进行30个循环; 72℃ 10min。用1%琼脂糖电泳检测扩增产物，阳性样品送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.3  VP2基因测序与分析  用DNAStar软件对分离株与参考毒株VP2基因核苷酸序列及其推导的氨基酸序列进行同源性分析。使用MEGA-X软件邻位相接法构建进化树。

1.4  致病性试验  新分离毒株和实验室保存的超强毒株分别经口服途径接种10只28日龄SPF鸡，攻毒剂量为106EID50/0.2mL。攻毒后每天观察鸡只临床症状，攻毒后2d和14d剖杀5只/组鸡观察法氏囊和腿肌病变。

2  结果

2.1  病毒分离鉴定与测序结果分析  临床病料接种SPF鸡胚后，培养6d未出现死胚。鸡胚绒毛尿囊膜研磨液RT-PCR检测结果显示IBDV阳性，分离毒株命名为GD2020株。

基因测序获得位于VP2基因631～1347nt的717bp长度的序列。对获得的序列进行同源性分析显示，分离株和新型变异株SHG115株同源性最高，核苷酸和氨基酸同源性分别为98.3%和99.1%;与早期变异株同源性偏低，核苷酸同源性仅为94.3%，见表1。

2.2  氨基酸序列变异分析  GD2020株具有变异株的特征性氨基酸222T、249K和286I，但不具有变异株特征性氨基酸254S。和早期变异株相比，GD2020株和SHG115株发生了5个氨基酸突变，分别为221K、252I、254N、263Y和299S，其中263Y和299S是经典毒株和超强毒株的特征性氨基酸，见图1。

核苷酸和氨基酸比对结果表明GD2020株属于变异株，但和早期的变异株相比，GD2020株又具有部分经典毒株和超强毒株的特点，属于新型变异株。

2.3  遗传进化分析  遗传进化分析结果表明，GD2020株与IBDV新型变异株SHG115株属于同一分支，与早期变异株和经典毒株亲缘关系较远，见图2。

2.4  致病力分析  口服接种SPF鸡后2d，超强毒株组死亡2只，新型变异株组无死亡。剖检可见超强毒株组和新型变异株组鸡只均出现法氏囊水肿，超强毒株组鸡只的法氏囊和腿肌严重出血，而新型变异株组鸡只的法氏囊仅有轻微出血，腿肌正常。攻毒后14d，超强毒株组和新型变异株组鸡只法氏囊均出现严重萎缩，见图3。

3  讨论

血清Ⅰ型的IBDV遍布全世界，基本所有的家禽主产区都有IBD发生，严重威胁着世界养鸡业的发展[4-5]。尽管各种疫苗在防控传染性法氏囊病中起到了重要作用，但随着美国变异株、欧洲超强毒株和中国新型变异株的出现，常造成鸡群的免疫失败，导致一定的经济损失，现今IBD仍是养禽业防控的重要对象[4]。本研究从广东某肉鸡场发生法氏囊和胸腺严重萎缩的鸡群中分离到1株法氏囊新型变异株病毒，该病毒感染不引起鸡只死亡和出现腿肌出血等典型临床症状，但攻毒后最早4d就可见法氏囊严重萎缩，推测该鸡场出现的高比例的弱小鸡问题可能与IBDV引起的免疫抑制有关。

早期研究发现，通过部分特征性氨基酸可以区分不同类型的IBDV毒株，这些氨基酸分别为超强毒株的222A、256I、294I和299S，变异株的249K和254S以及弱毒株的253H、279N、284T和330R[6]。本研究分离毒株和早期变异株相比，发生了多个氨基酸突变，其中212D和263Y与经典毒株氨基酸序列相同，299S是超强毒株的特征性氨基酸，提示IBDV新型变异株可能是早期变异株和经典毒株的重组病毒。为了有效控制IBDV新型变异株感染，病毒流行动态监控、现有疫苗保护效果评价和新疫苗研发等工作需要继续开展。

参考文献：

[1]  Muller H， Islam M R， Raue R. Research on infectious bursal disease--the past， the present and the future [J]. Vet Microbiol， 2003：97（1-2）： 153-165.

[2]  Saif YM.禽病學[M].第十二版.北京：中国农业出版社，2012：951-952.

[3]  Fan L， Wu T， Hussain A， et al. Novel variant strains of infectious bursal disease virus isolated in China [J].Vet Microbiol， 2019：230： 212-220.

[4]  范林进，王雨龙，吴甜甜，等.我国传染性法氏囊病病毒新型变异株分析研究[J].中国预防兽医学报， 2019：41（11）：1164-1169.

[5]  刘存霞，费亦东，王锐，等. 吉林地区一株鸡传染性法氏囊病毒的分离与鉴定[J].家禽科学，2018：（10）：5-9.

[6]  Ren X， Xue C， Zhang Y， et al. Genomic analysis of one Chinese strain YS07 of infectious bursal disease virus reveals unique genetic diversity [J]. Virus Genes. 2009：39（2）：246-8.