禽偏肺病毒分子生物学诊断方法研究进展*

于新友，李天芝

(山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600)

禽偏肺病毒(Avianmetapneumovirus，aMPV)属于副黏病毒科、偏肺病毒属[1]，可感染火鸡、鸡、雉鸡、珍珠鸡、鸵鸟等多种禽类，引起禽类呼吸道症状、头部肿胀和产蛋率下降等。火鸡鼻气管炎、禽鼻气管炎和鸡肿头综合征等多种疾病都因aMPV感染而发生，这类疾病也成为禽偏肺病毒病。主要通过水平方式传播，尚未有垂直传播的证据。根据抗原性和基因特异性，aMPV分为 A型、B型、C型、D型4种型[2]，其中A型、B型在世界范围广泛流行，C型、D型在局部地区流行。各日龄禽类均可感染，4～7周龄发病率高。该病传染性强，传播迅速，病程可持续2～3周，单独感染时仅出现一过性轻微呼吸道症状，死亡率不超过5%，当混感或继发其它疾病时，死亡率可高达40%[3]，给养禽业造成了严重的经济损失[4]。

1978年，南非共和国首次报道了aMPV引起的火鸡鼻气管炎，并于1989年成功分离到病毒，随后英国、美国、以色列、法国、日本等国均有报道。1998年我国大陆学者沈瑞忠首次从肿头综合征肉鸡中分离了aMPV[5]，目前已证实aMPV在我国鸡群感染率高[6]，包括A型、B型、C型3种血清型。aMPV病毒粒子可呈椭圆形、圆形等多种形状[7]，直径大小80～200nm，有囊膜；表面有纤突，长约 13～14nm，不能凝集红细胞；对乙醚敏感，不耐热，56℃ 30min可灭活，pH值为3～9时病毒可保持稳定，当存在有机物时，病毒外界抵抗力强，20℃条件下家禽垫料中病毒可存活4周，37℃时可存活长达2周，常用的消毒剂如过氧乙酸、2%的氢氧化钠溶液、戊二醛、2%的甲醛溶液均能有效杀灭病毒。aMPV核酸为不分节段、单股负链RNA，基因组长度约为14kb，共编码8种结构蛋白，从 3′端到 5′端依次为核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、第二基质蛋白（M2）、小疏水蛋白（SH）、糖蛋白（G）和聚合酶蛋白（L）。本文就近年来aMPV的分子核酸探针法、常规RT-PCR 法、套式RT-PCR法、荧光RT-PCR方法、环介导等温扩增技术等5种生物学诊断方法研究进展进行综述，以期为禽偏肺病的快速诊断和防控提供参考。

1 核酸探针法

核酸探针是利用核苷酸碱基顺序互补的原理，用特异的基因探针与被测定的靶序列互补，以检测被测靶序列的技术，可定性或定量检测特异RNA或DNA序列，它具有操作简单、结果易于判定等优点，适合在基层推广使用。陈琳等[8]根据GenBank中已经发表的B亚型aMPVF基因的保守序列设计并合成1对引物，利用RT-PCR扩增出1条与目的片段大小一致的725bp基因片段，回收、纯化PCR产物，用地高辛标记，制备出地高辛标记的aMPV核酸探针。特异性检测结果表明，该探针能与aMPV核酸发生特异性杂交，而与H9N2亚型 AIV、NDV、IBV、ORT 和 E.coil的核酸杂交反应均为阴性，敏感性检测结果表明，该探针对aMPV的最低检出量为5pg。

2 常规RT-PCR法

RT-PCR是以病毒的RNA为模板进行反转录，再以PCR进行核酸扩增来检测病毒的方法，较病毒分离鉴定等传统的方法的检测速度更快、灵敏度更高，在动物疾病诊断上得到了广泛的应用。陈琳等[9]根据GenBank中已经发表的B亚型aMPVF基因的保守序列设计并合成1对引物，利用RT-PCR可以扩增出1条725bp的片段，进行特异性试验和敏感性试验，建立了aMPV病的RT-PCR检测方法。特异性试验表明，建立的RTPCR检测方法能够从aMPV疫苗毒株VIR115-B中扩增到725bp的特异性片段，而对H9N2亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒的扩增结果均为阴性，敏感性试验表明，该方法最低检出量的cDNA质量浓度为1.45μg/L，对山东省492份病料进行检测，阳性检出率为43.09%(212/492)，随机挑取11份进行克隆测序及序列分析，结果显示所扩增到的阳性产物均为B亚型的aMPV。

3 套式RT-PCR法

套式RT-PCR，又称巢式RT-PCR。采用两对引物扩增目的基因片段，第2对引物在第1对引物的内部设计，以第1对引物的扩增产物为模板进行再次扩增，经两轮扩增，保证的扩增产物的特异性，提高了PCR检测的敏感性。薛聪等[10]根据GenBank发布的B亚型aMPVF基因的保守序列设计2对引物，建立了一种适用于B亚型aMPV的逆转录套式PCR检测方法。此方法具有高度特异性和敏感性，以H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒作为模板进行扩增，结果均为阴性。经检测，该方法第1次 PCR扩增的敏感性为107copies/μl，第2次扩增的敏感性为102copies/μl，第2次扩增敏感性比第1次高105倍。

4 荧光RT-PCR方法

荧光RT-PCR是在常规RT-PCR技术基础上发展起来的一种高度灵敏的核酸定量技术，它融汇了传统PCR技术灵敏、快速、特异的特点以及光谱技术的高敏感性和高精确定量的优点，检测速度快、敏感高，可直接观察扩增结果，不需要后续电泳检测扩增产物，减少了对环境气溶胶污染的可能，避免了假阳性结果。据信号基团的不同，实时荧光定量 PCR可以分为染料法和探针法两种。王丽荣等[11]根据GenBank登录的B亚型aMPVF基因序列设计1对特异性引物，建立SYBRGreenⅠ荧光定量PCR标准曲线，并做敏感性试验、特异性试验和重复性试验。结果表明，标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系，产物 T值在 83.0～83.7℃之间，灵敏度为 7.9×102拷贝/μl，特异性和重复性较好。刘佳佳等[12]根据GenBank中C型aMPVP基因序列，设计出一对特异性引物和Taqman探针，建立了C型aMPV Taqman探针荧光定量PCR方法。结果表明，该方法只对C型aMPV检测为阳性，具有良好的特异性，能够检测到(3.63×102)拷贝数，具有良好的敏感性，建立的标准曲线斜率为-3.312，截距为44.66，相关系数为R2=0.999，循环阈值和模板拷贝数具有良好的相关性，组内及组间重复性好。陈基明等[13]根据GenBank发表的aMPVF基因序列，设计一对特异性引物，建立C亚型aMPV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。对该反应体系进行条件优化，建立了标准曲线，并进行特异性、敏感性及重复性试验，然后将建立的方法应用于临床样品和攻毒样品的检测。结果显示：标准曲线循环阈值与模板浓度呈现良好的线性关系，建立的方法只能检测出C亚型aMPV，最低可以检测到0.8×101拷贝/μl的核酸模板，重复性试验的变异系数小于4%。应用建立的方法对43份临床样品检测，结果显示均为阴性，对42份35日龄SPF鸡人工感染后1～21d的气管和肺脏样品进行检测，结果显示攻毒样品均为阳性。

5 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增 (LAMP)方法是日本学者Notomi等发明的一种新的适用于基因诊断的恒温核酸扩增技术，不需要复杂的仪器设备，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，结果可通过肉眼观察白色浑浊或绿色荧光的生成来判断，简便快捷，具有灵敏度高、操作简单、反应时间短、临床使用不需要特殊的仪器等优点，特别适合在现场和基层部门应用。鞠小军等[14]针对B亚型aMPVF基因的特异性引物，并从反应时间、温度、各组分浓度等方面优化了反应体系和反应条件，建立了B亚型aMPV逆转录环介导等温核酸扩增 (RT-LAMP)快速检测方法。该方法能够在63℃条件下1h内实现B亚型aMPVF基因片段的特异性扩增，与其他病毒，如H9N2亚型禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)等的核酸无交叉反应。反应结果可直接用肉眼判断。对质粒DNA的最小检测量为1×102拷贝/μl。

6 小结

疾病的正确诊断是进行有效防控的前提和基础，随着规模化养殖的发展，临床上的禽病变得越来越复杂，老病新发和疾病混感现象增加，很难通过临床表现和眼观病变诊断疾病，需要通过实验进行精准诊断，从而及时采取有效的措施，降低损失。aMPV病虽然在火鸡上存在几十年了，也是对火鸡危害最严重的几种疾病之一，但在鸡上的研究并不多，主要引起鸡肿头综合征和减蛋下降，近年来引起关注。由于病毒分离培养难度大，血清学诊断不能判定是否现症感染，且易混感其它疾病的特点，更增加了疾病的诊断难度，当前主要依靠分子生物诊断进行确诊，虽然aMPV分子生物学检测方法多样，但各有利弊，常规RT-PCR方法虽然检测速度快、特异性强，但不能定量，且检测敏感性不高。荧光RT-PCR方法虽然克服了常规RT-PCR的缺陷，但仪器和探针的合成价格昂贵，检测成本比较高，不适合基层应用。LAMP方法虽然简单、方便，适合基层进行推广应用，但灵敏度太高，易出现假阳性结果。

随着技术的不断发展，已经出现了免核酸提取荧光PCR扩增技术、便携式荧光PCR仪器及除模板外PCR组份冻干保存技术，如能应用于aMPV分子检测，必将开发出更方便、快捷、成本更低的病毒分子检测技术，方面疾病快速确诊，从而更好做好禽偏肺病毒病的防控工作。针对该病尚无有效的治疗方法，国内也无疫苗预防，确诊后只能对症治疗，从生物安全方面进行控制，加强饲养管理，提高禽类机体抗病力。禽舍定期通风、降低氨气浓度、减少饲养密度、减少应激以降低禽偏肺病毒发病率和病情的严重程度。