血清4 型禽腺病毒的实验室诊断方法研究进展

郑洪玲

（辽宁省农业发展服务中心， 辽宁 沈阳 110033）

心包积液综合征是肉鸡的一种严重传染病，其特征是心包囊内积有一种透明的液体，并伴有肾炎和肝炎[1]。血清4 型禽腺病毒（Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4）是心包积液综合征的病原体，该病毒对鸡，特别是对3～5 周龄的肉鸡具有很强的致病性，可以通过垂直和水平传播[2]。自1987 年FAdV-4 在巴基斯坦首次暴发以来，该病毒已传播到亚洲、中南美洲和欧洲一些国家和许多地区，成为过去30 年给家禽业造成严重经济损失的首要原因之一[3]。FAdV-4 感染的主要靶器官是肝脏，临床上能够从感染肉鸡的肝脏匀浆中分离出该病毒，并能通过多种实验室诊断方法检测到。本文对FAdV-4 实验室诊断技术的研究进展进行了综述，以期为我国新发FAdV-4 的防控提供理论依据和技术支撑。

1 透射电镜诊断

临床中，诊断疑似感染FAdV-4 病例的依据主要是3～6 周龄肉鸡突然出现高死亡率，并表现出心包积液、肾炎和肝炎等症状和病理变化。透射电镜的应用，使病毒、细菌、真菌及原生动物的超微结构检查成为可能，在微生物的诊断中起着至关重要的作用。它利用透射电镜从疑似感染FAdV-4 肉鸡的肝脏匀浆、肝细胞中观察到离散的病毒颗粒，具有典型腺病毒外观，六边形、二十面体、无包膜，直径约75 nm，从而对疑似病例进行确诊，并证实了FAdV-4 是心包积液综合征的病原体。从受感染动物的血液、体液或组织中分离病毒也是病毒感染诊断的金标准，而原代鸡肾、鸡胚肾、鸡胚肝、鸡胚成纤维细胞和QT-35 细胞均可用于FAdV-4 的分离。李乔斌等选用鸡肝癌细胞进行FAdV-4 的分离培养，并利用电镜技术等对分离病毒进行鉴定，结果显示在电镜下可观察到FAdV-4 的细胞培养物有大量病毒粒子的存在[4]。

2 分子生物学诊断技术

目前，限制性内切酶分析、DNA 探针原位杂交、PCR、实时PCR、环介导等温核酸扩增技术（LMAP）和高分辨率熔解曲线分析（HRM）等分子生物学诊断方法均可用于FAdV-4 的检测和鉴定[5]。限制性内切酶分析最初用于禽腺病毒分离株的分组和毒株的分型。根据BamH I 和Hind III消化产生的DNA 基因组相似性，将17 株禽腺病毒菌株的11 个血清型分为5 组（A～E）。尽管血清4 型和10 型禽腺病毒之间存在双向交叉中和作用，但采用Hind III、Dra I、Xba I、Not I、Sfi I、Bgl II、Sma I 和NaeI 的限制性内切酶分析发现差异不大。一些报道称可以利用原位杂交直接检测禽腺病毒DNA 与特定探针，但由于该方法操作复杂，还有更方便、可靠的其它诊断方法，因此目前在临床诊断上的应用并不广泛。

PCR 方法具有灵敏度高、操作简单和快速的优点，一直以来是检测禽腺病毒的主要方法。目前已发表的禽腺病毒PCR 检测技术的主要靶基因包括腺病毒的六邻体基因（hexon）的保守基因区（P1，P2）和可变环区域（L1～L4），研究者针对可变区和保守区都设计过引物[6]。利用2 对在保守区杂交的PCR 引物与限制性内切酶分析结合，使PCR 和限制性内切酶分析能够检测和区分所有12 株禽腺病毒参考菌株。利用针对hexon 基因可变区域的引物，通过PCR 结合Southern 杂交成功地从印度一例心包积液综合征病例中检测到FAdV-4[7]。目前，将hexon 基因的PCR 产物直接测序，所得信息可用于鉴定禽腺病毒及其血清型。Fu 等从临床诊断为心包积液综合征的广东鸡中分离出FAdV-4 毒株，并建立了基于hexon 基因的禽腺病毒特异性PCR 检测方法，能够快速对死鸡的心脏和肝脏组织样本进行FAdV-4 检测，并研究其hexon 基因核苷酸序列的异同[8]。此外，Fiber 是禽病毒表面重要的纤突蛋白，能够编码型特异性中和、型特异性非中和和亚属特异性中和表位，因此常被用于检测禽腺病毒。有人建立了基于Fiber 的PCR-限制性内切酶分析技术，这是一种新的、可靠的方法，可以用来鉴定FAdV-4 分离株[9]。

上述传统的PCR 方法是临床快速检测禽类病毒病原体的一种简单而敏感的工具，但该技术无法量化病毒载量。为了克服这一缺陷，研究者们进一步报道了使用基于SYBR green 的实时PCR方法来检测和量化所有禽腺病毒。刘琳等[10]、罗洋洋等[11]、宋玲玲等[12]众多研究者分别针对Hexon 基因序列设计引物和探针，建立了FAdV-4的TaqMan 探针荧光定量PCR 检测方法，这些方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点，均可用于临床样本的检测。与此同时，研究者还开发了qPCR、巢式 PCR 和LAMP 等灵敏度更高、特异性更强的方法。钟鸣针对已公布的禽腺病毒全基因序列的高度保守区域设计特异性引物建立了一种FAdV-4 巢式PCR 检测方法，同时针对FAdV-4 的Hexon 基因序列建立了特异性LAMP检测方法，并对其反应条件和反应体系进行优化，结果显示两种检测方法中，LAMP 检测方法的特异性和灵敏性更佳[7]。栾勇娇设计筛选了两套LAMP 引物和2 条分子信标探针，建立了鉴别诊断FAdV-4 变异株和非变异株的双重荧光LAMP检测方法[5]。如前所述，将PCR 与限制性内切酶分析和/或DNA 测序相结合，可用于基因分型和区分所有12 种禽腺病毒血清型，但这些组合方法相对昂贵和耗时，而且往往需要大量的分析，这就限制了它们作为常规血清分型方法的使用范围。近年来，高分辨率熔解曲线分析为遗传变异的直接基因分型提供了一种简单且成本较低的替代方法。该方法针对禽腺病毒结构蛋白编码基因hexon的L1 区设计引物HexL1s/HexL1，通过对约590 bp大小的 PCR 产物的熔解曲线分析显示，熔解曲线具有高度重复性和可区分性，有一个或多个主峰，是一种简单、灵敏和特异的基因分型和区分所有12 种禽腺病毒血清型的方法。王冬雪建立的PCRHRM 方法对腺病毒实现了准确、快速的基因分型，该方法主要是针对Ⅰ群禽腺病毒进行鉴定[13]，而目前针对FAdV-4 的PCR-HRM 方法还有待进一步探索。

3 血清学技术

目前，间接血凝试验、间接免疫荧光试验、琼脂糖凝胶沉淀试验、琼脂糖凝胶免疫扩散试验、病毒中和试验和酶联免疫吸附试验（ELISA）等多种血清学技术已用于诊断家禽FAdV-4 感染。最初，基于实验室制备的高免血清，利用间接免疫荧光试验、琼脂糖凝胶沉淀试验和琼脂糖凝胶免疫扩散试验，在感染后家禽的肝脏或不同组织的匀浆提取液中检测到FAdV-4。而间接血凝试验可以用于疫苗接种后的抗体效价检测，还可用于从被感染的鸡中检测针对FAdV-4的抗体。研究显示，病毒中和试验被用于区分禽腺病毒的血清型和评估疫苗诱导产生的抗体反应，是一种敏感性和准确率更高的方法，但病毒中和试验的缺点是昂贵和耗时，因此，必须在合理的情况和有条件时使用。

近年来，FAdV-4 血清学技术的研究进展主要集中在对ELISA 方法的改进和优化方面。在早期研究中，采用全病毒作为包被抗原的间接ELISA法，被用来检测自然感染和实验感染鸡的组织样本中的FAdV-4 抗体，但试验中病毒抗原的制备相对繁琐和低效，敏感性和特异性也不是很高。后来，研究人员开发了一种夹心ELISA 方法，用来检测实验感染鸡的各种组织，包括肝脏、脾脏、法氏囊、胸腺和肾脏中的FAdV-4 抗原[14]；该方法具有较高的灵敏度和特异性，可在较低浓度条件下检测出FAdV-4 抗原。最近，有研究者利用原核表达系统成功表达和纯化了FAdV-4 结构蛋白和非结构蛋白。武小倩[15]、He[16]等分别建立了基于fiber-1和fiber-2 蛋白的FAdV-4 特异性间接ELISA 检测方法；田开月等针对中国流行株的fiber-2 蛋白进行原核表达后建立了间接ELISA 检测方法[17]；申秋平建立的ELISA 检测方法则是基于FAdV-4 的非结构蛋白[18]。这几种重组蛋白的ELISA 方法具有较高的灵敏度、特异性、准确性和重复性，易于标准化，更适合大规模应用。

4 小结

在感染鸡的12 种血清型FAdV 中，FAdV-4是主要的流行株，对肉鸡具有较高的致病性，严重危害我国的养鸡业，带来的经济损失近年来也迅速增长。因此，我们应该格外重视该病原的流行病学调查、诊断检测和防控等工作，而使用快速有效的检测方法尤为重要。本文提到的琼脂糖凝胶免疫扩散试验、间接免疫荧光分析、酶联免疫吸附试验、限制性内切酶分析、聚合酶链式反应（PCR）、实时PCR、LAMP 和HRM 等方法，主要归纳为分子生物学和血清学检测两类，是目前检测FAdV-4 感染常用的实验室诊断方法。研究者根据实际感染情况和试验条件从中选择合适的方法，能够快速检测禽腺病毒感染，从而为该病的防控赢得时间。