Ⅰ群4型禽腺病毒蛋黄抗体中和效价与攻毒保护相关性研究*

李斌，路晓，刘美丽，赵鲁宁，张帆，于可响，韩易航**

（1.烟台爱士津动物保健品有限公司，山东 烟台 264003；2.山东省农业科学院家禽研究所，山东 济南 250100；3.内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古 呼和浩特 010018）

在家禽和野禽常见的传染病病原中，禽腺病毒（Fowl adenvirus，FADV）占据了重要地位。该病毒属于禽腺病毒科禽腺病毒属，分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3个亚群。Ⅰ亚群有A、B、C、D、E 5个种，血清型共12个[1-3]，其中血清4型禽腺病毒引起的心包积液-肝炎综合征（又称安卡拉病）对禽类的危害最为严重。1987年巴基斯坦首次报道安卡拉病，主要症状为严重的心包积液及肝脏肿大、变脆、出血或坏死。2015年该病在我国开始暴发，给家禽养殖业造成了严重的经济损失[4-8]。

大量临床实践证明，抗生素、中兽药、干扰素、转移因子等常规药物对安卡拉病无明显的疗效，蛋黄抗体被证明是一种有效的防控与治疗手段[9-14]。本实验选用3批Ⅰ群4型禽腺病毒蛋黄抗体，进行抗体效价与靶动物免疫攻毒保护效果相关性试验，以证明选用的中和抗体效价作为产品效检标准的合理性，并为建立效检标准和临床治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

21日龄SPF鸡，购自济南赛斯家禽科技有限公司。

3批Ⅰ群4型禽腺病毒蛋黄抗体，均由烟台爱士津动物保健品有限公司制备。

Ⅰ群4型禽腺病毒中和用种毒、攻毒用种毒和LMH细胞，由山东省农业科学院家禽研究所提供。

1.2 试验试剂

胎牛血清、DMEM培养基、胰蛋白酶均购自赛默飞世尔；氯化钠购自国药集团化学试剂有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 中和用种毒毒价的测定 将毒种用DMEM维持液作10倍系列稀释，取10-6、10-7、10-8、10-9四个稀释度，接种LMH传代细胞（96孔微量细胞培养板），每个稀释度接种8孔，每孔0.1 mL，置37 ℃、5%CO2培养箱中培养96 h。每日观察，记录CPE情况，按Reed-Muench法计算TCID50。

1.3.2 攻毒用种毒半数致死量的测定 将攻毒用毒种用生理盐水作10倍系列稀释，取10-3、10-4、10-5、10-6四个稀释度，每个稀释度经皮下接种21日龄SPF鸡10只，每只0.2 mL。观察10日，记录SPF鸡死亡情况，按Reed-Muench法计算半数致死剂量（LD50）。

1.3.3 抗体中和效价的测定 用DMEM维持液对待检抗体作2倍系列稀释，取适宜稀释度（1：128、1：256、1：512、1：1024 等）分别与中和用种毒（含200 TCID50/0.2 mL）等量混合，置37 ℃中和1 h，接种LMH传代细胞，每个稀释度接8孔，每孔0.2 mL；同时设病毒对照组8孔，每孔接种同等条件处理的病毒液与DMEM维持液等量混合液0.2 mL；抗体空白对照组8孔，每孔接种同等条件处理的待检抗体稀释液（1：128）与DMEM维持液等量混合液0.2 mL；空白对照组8孔，每孔接种DMEM维持液0.2 mL。置37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养96 h。每日观察，记录CPE情况。病毒对照组细胞应全部出现细胞圆缩、脱落等特征性病变，抗体空白对照组和空白对照组细胞应生长正常。按Reed-Muench法计算其中和抗体效价。

1.3.4 抗体的稀释 将3批Ⅰ群4型禽腺病毒蛋黄抗体进行连续稀释，稀释至中和效价分别为1：64、1：128、1：256，置 4 ℃保存待用。

1.3.5 预防试验 取21龄SPF鸡30只，随机分为3组，每组10只。试验组SPF鸡经颈背部皮下注射中和效价分别为1：64、1：128、1：256的Ⅰ群4型禽腺病毒蛋黄抗体，每只0.5 mL，注射抗体168 h后，接种Ⅰ群4型禽腺病毒攻毒用强毒0.2 mL（100LD50）。另取同批次SPF鸡20只，作为攻毒对照组和健康对照组，每组各10只。攻毒对照组，不注射抗体，进行强毒攻击；健康对照组，不做任何处理。观察10日，记录SPF鸡临床变化。共进行3批实验室试制产品的试验。

1.3.6 紧急预防试验 取21龄SPF鸡30只，随机分为3组，每组10只。试验组SPF鸡肌肉注射Ⅰ群4型禽腺病毒攻毒用强毒0.2 mL（100LD50），36 h后将上述不同效价的抗体经颈部皮下注射SPF鸡。另取同批次SPF鸡20只，作为攻毒对照组和健康对照组，每组各10只。攻毒对照组，进行强毒攻击，不注射抗体；健康对照组，不做任何处理。连续观察10日，记录SPF鸡临床变化。共进行3批实验室试制产品的试验。

2 结果

2.1 中和用种毒的毒价

利用LMH细胞测定中和用种毒的毒价，其TCID50为 10-8.00/0.1 mL。

2.2 攻毒用种毒的半数致死量

利用21日龄SPF鸡测定攻毒用种毒的半数致死量为10-4.00/0.2 mL。

2.3 抗体的中和效价

利用LMH细胞测定3批抗体的中和效价，结果显示，3个批号的抗体中和效价分别为1：418、1：472和1：447。

2.4 抗体的预防试验

将3批抗体稀释成不同中和效价后，分别注射21日龄SPF鸡，168 h后进行攻毒，结果显示，当抗体的中和效价达到1：128时，保护率均达到80%以上，攻毒对照组SPF鸡100%死亡；健康对照组SPF鸡100%健活（表1）。

表1 预防试验中不同抗体效价与攻毒保护相关性

2.5 抗体的紧急预防试验

21日龄SPF鸡先注射Ⅰ群4型禽腺病毒，36 h后注射不同中和效价的抗体，结果显示，当抗体中和效价为1：128时，攻毒保护率均达到80%以上；当中和效价为1：256时，攻毒保护率均达到90%以上；攻毒对照组SPF鸡100%死亡；健康对照组SPF鸡100%健活（表2）。

表2 紧急预防试验中不同抗体效价与攻毒保护相关性

3 讨论

鸡心包积液-肝炎综合征对2～4周龄的肉鸡危害严重，发病率高，死亡快，发病鸡群往往未见明显临床症状时死亡率突然升高，个别鸡群日死亡率可高达10%左右，整个发病周期死亡率可达60%以上。临床数据表明，高免蛋黄抗体对该病具有显著的预防和治疗效果，但抗体的最低使用效价目前还没有报道。为了确定Ⅰ群4型禽腺病毒蛋黄抗体中和效价与攻毒保护效果的相关性，本研究将3批实验室试制抗体分别通过预防试验和紧急预防试验模型，进行抗体中和效价与靶动物攻毒保护力相关性试验，试验结果均表明随着抗体中和效价的升高，对SPF鸡的攻毒保护率也随之升高，即抗体中和效价与攻毒保护率呈正相关。由此，抗体中和效价测定可代替SPF鸡攻毒保护试验，作为抗体的效检标准。当中和效价为1：128时，攻毒保护率均达到80%以上。为确保临床效果，可将Ⅰ群4型禽腺病毒蛋黄抗体效检标准暂定为抗体中和效价不低于1：256。

本研究通过预防试验和紧急预防试验模型，进行了Ⅰ群4型禽腺病毒蛋黄抗体中和效价与靶动物攻毒保护力相关性试验，验证了抗体在安卡拉病的预防和紧急预防中具有良好的效果，并且确定了抗体的效检标准和使用效价，对卵黄抗体的研发和安卡拉病的临床治疗具有重要的指导意义。