血清4型禽腺病毒的分离鉴定及动物回归试验

李琳，杨金生，赵寒冬，袁陆，管郡，王楠，刘云志*

（1.吉林省畜牧兽医科学研究院，吉林 长春 130062；2.长春农业博览园，吉林 长春 130117 ；3.大安市畜牧总站，吉林 大安 131300）

血清4型禽腺病毒感染即肝炎-心包积液综合征，又叫心包积液综合征，是由血清4型禽腺病毒（Fowl adenovirus serotype 4，FADV-4）引起的一种急性传染病[1]。本病典型的发生过程是鸡在3周龄出现死亡，在4～5周龄出现死亡高峰，然后死亡率开始下降。本病潜伏期短，发病快，呈急性死亡，死亡率在20%～80%。本病于1987年在巴基斯坦安卡拉地区首次暴发，因此也被称为安卡拉病[2]。随后在世界多个国家和地区均有报道，我国于2006～2014年有零星出现，2015年后在全国多个省份快速流行，给养禽业造成了巨大的经济损失[3]。禽腺病毒属共3个群，14个血清型，其中禽腺病毒血清4型属Ⅰ群可引起鸡的安卡拉病。由于Ⅰ亚群腺病毒作为原发病原的作用尚未搞清楚，不同的血清型，甚至相同血清型的不同毒株，其致病力和感染力差异很大，在造成发病和死亡或者引发呼吸道疾病的能力也有所不同。但当它与传染性法氏囊病毒共同感染却可增强禽腺病毒的致病性，共同感染鸡贫血病病毒时能大大增强禽腺病毒引起肝炎和致死能力。本实验室此次分离获得的致病血清4型禽腺病毒毒株，初步命名为FADV-4 CC株，为下一步病毒的遗传演化规律研究和发病分子机制研究打下基础，并对该病在吉林省的流行防控、抗病毒药物的筛选、疫苗研制都将具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 病料来源

2022年6 月吉林省长春市某蛋鸡养殖场送检49日龄病死鸡（品种为海兰褐），截止送鸡前，死亡率达到20%以上，发病率在80%左右。病鸡临床主要表现为精神沉郁、羽毛成束，有明显的呼吸道和神经症状。

1.2 主要试剂

琼脂糖（分析纯），50×TAE缓冲液，PBS，DL2000 DNA Marker，10×Loading Buあer，双蒸馏水，PCR 用 ExTaq，10×ExTaq Buあer，dNTP Mixture，传染性法氏囊病抗原快速检测试纸（河南百奥生物工程有限公司）等。

1.3 引物设计与合成

引物设计主要参照安徽省地方标准《I群血清4型禽腺病毒核酸PCR检测技术规程》（DB 34/T 3121—2018）[4]。上游引物 P1：FADV-4(5'-GACCGTTACAAGTTTAGCATCTCC -3')，下游引物P2：FADV-4(5'- TCGCAGGAAGTCGTAGTGGA-3')，扩增核酸片段大小为951 bp，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。如果样品的PCR产物电泳后在951 bp位置出现特异性的条带，则判定为禽腺病毒4型核酸检测阳性，反之为阴性。

1.4 病料处理与分离

无菌采取病鸡心包积液、肝脏、脾脏、肾脏接种血琼脂平板培养基，同时对病鸡肝脏按1∶5 (V/V)比例加入生理盐水研磨，反复冻融3次，经10 000r/min高速离心1 h，取上清液接种7日龄SPF鸡胚（卵黄接毒），采集尿囊液，用尿囊液提取的核酸作为 DNA 模板进行 PCR 扩增。

1.5 PCR扩增禽腺病毒鉴定的反应体系

10×ExTaq buffer(Mg2+plus) 2.5 μL ，dNTP Mixture 1 μL，P1：FADV-4（10 μM）0.5 μL，P2：FADV-4（10 μM）0.5 μL，ExTaq 酶 0.3 μL，DNA 模板（质量浓度大于 129.6 pg/μL）2 μL，灭菌双蒸水补至 20 μL，扩增参数为：第一阶段94 ℃预变性5 min；第二阶段94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，30个循环；第三阶段 72 ℃延伸 10 min，PCR扩增产物通过1.0%的琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观察结果。

1.6 血凝试验（HA）、试纸条检测

鉴于送检病料需要实验室病毒分离鉴定及后期鸡群治疗，检测是否有混合感染发生，因此通过常规血凝试验和传染性法氏囊病抗原快速检测试纸，检测病鸡是否患有新城疫、禽流感和传染性法氏囊病这几个主要易发疫病。

1.7 回归试验

试验将15日龄的SPF鸡分攻毒组和对照组，各5只。攻毒组中5只鸡均肌肉注射尿囊液0.5 mL，其余5只鸡肌肉注射生理盐水0.5 mL。

2 结果与分析

2.1 剖检及细菌学检查结果

对送检病死鸡进行剖检，可见心脏被淡黄色透明液体包裹，肝脏肿大、变黄（图1）、有出血点（图2），肾脏肿大，肠道无明显病变。病料经血琼脂平板培养基37 ℃培养24 h，无细菌生长。经询问，鸡场还未接种过腺病毒任何疫苗。

图1 病死鸡心包积液，肝脏肿大变黄

图2 病死鸡心包积液，肝脏有出血点

2.2 血凝试验、试纸条检测结果

采集尿囊液进行血凝试验，不能凝集1%鸡红细胞悬液，证明分离毒株无血凝性，对照组新城疫病毒凝集1%鸡红细胞悬液；传染性法氏囊病抗原快速检测试纸检测呈阴性，因此分离毒不含传染性法氏囊病毒。

2.3 病毒分离和增殖

接种7日龄SPF鸡胚5枚，置37 ℃继续孵化，鸡胚分别于接种后3日死亡3枚，4日1枚，5日死亡1枚，无菌采集死亡鸡胚的尿囊液。

2.4 PCR 扩增结果

以尿囊液提取的核酸作为DNA模板，通过PCR检测，在951 bp处出现目的条带，阴性对照未见特异条带（图3）。

图3 血清4型禽腺病毒的PCR鉴定

2.5 回归试验

用无菌采集的尿囊液既命名为FADV-4 CC株攻毒15日龄的SPF鸡，发病率和死亡率均为100%（5/5），剖检死亡攻毒鸡发现肝脏肿大变黄明显，心脏被一层薄膜包裹，可见明显心包积液（图4和图5）。对照组鸡只无临床症状，均健康存活。

图4 攻毒SPF鸡肝脏变黄、有出血点，可见心包积液

图5 攻毒SPF鸡肝脏明显变黄

3 小结

禽腺病毒属于腺病毒科禽腺病毒属成员为双股DNA病毒。血清4型禽腺病毒属于禽腺病毒C种成员FAV-4型，被认为是引起鸡心包积液综合征的病原[5]。本病可垂直传播也可水平传播，以心脏被淡黄色透明液体包裹、肝脏肿大为特征。养殖户一般均在70日龄首免，30日后进行第二次免疫，一些养殖户开产前还进行一次加强免疫。由于个别养殖场周边没有发生过腺病毒，养殖户抱有侥幸心理不接种腺病毒疫苗，近年来导致该病毒在某些地区仍有零星发生。该病暴发突然，发病率高，治疗后蛋鸡产蛋量只能达到80%～85%左右，且后期一些处于亚健康鸡只由于免疫力低仍会有零星死亡，给养殖场造成了一定的经济损失。因此，在加强饲养管理的同时，建议通过新流腺三联灭活疫苗【鸡新城疫、禽流感（H9亚型）、禽腺病毒病（I群4型）三联灭活疫苗（La Sota株+YT株+QD株）】或新流法腺四联灭活疫苗来对本病进行有效预防和控制。对未接种疫苗鸡场，建议及时补免。若发生疫情应先缓解临床症状，采用中药抗病毒药同时用抗生素，以此提高机体的免疫力，补免完成的同时要密切关注群体，防止应激的发生。