施氏假单胞菌PFS-4的筛选、优化固定及其对二氯喹啉酸的降解性能

张 可，吴艺琪，陈 伟，格 桑，陈 佳，罗鸿兵①

(1.四川农业大学土木工程学院，四川 都江堰 611830；2. 哈尔滨工业大学市政环境工程学院，黑龙江 哈尔滨 150090)



施氏假单胞菌PFS-4的筛选、优化固定及其对二氯喹啉酸的降解性能

张 可1，吴艺琪2，陈 伟1，格 桑2，陈 佳1，罗鸿兵1①

(1.四川农业大学土木工程学院，四川 都江堰 611830；2. 哈尔滨工业大学市政环境工程学院，黑龙江 哈尔滨 150090)

从长期施用二氯喹啉酸的土壤中分离到1株能以二氯喹啉酸为碳源生长的菌株，命名为PFS-4。经16S rRNA基因序列和生理生化特性分析，将菌株PFS-4鉴定为施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)。以麦秆吸附-海藻酸钠包埋方式对菌株进行复合固定，采用正交实验对固定条件进行优化，研究温度、pH值、碳源对固定化菌剂降解二氯喹啉酸的影响；考察固定化菌剂对污水中二氯喹啉酸的去除效果，并对比分析游离菌及固定化菌剂去除能力的差异。结果表明，固定化菌剂制备的最佳条件为：海藻酸钠质量分数为5%，CaCl2为4%，菌胶比1∶2，交联时间5 h。在温度为30 ℃、pH值为7的条件下，经5 d培养，固定化菌剂对500 mg·L-1二氯喹啉酸降解率为92.3%。在处理污水中二氯喹啉酸时，游离菌的降解能力受到极显著抑制 (P<0.01)，而对固定化菌剂降解率影响相对较小，去除率保持在64%以上。麦秆吸附-海藻酸钠包埋固定化菌剂对不良环境具有较好缓冲性，可用于微生物降解菌的开发利用。

二氯喹啉酸；麦秆-海藻酸钠复合载体；固定化；微生物降解

二氯喹啉酸(quinclorac)为一种选择性苗后处理除草剂,属于激素型喹啉羧酸类药剂,主要用于防治稻田中稗草和其他禾本科杂草[1]。该药剂性质较为稳定[2-3],同时具有一定的水溶性,可通过径流等形式造成水体污染。二氯喹啉酸污染水体的修复方法主要有光催化降解、生物炭吸附以及微生物降解[4],其中微生物修复因在环境友好方面具有独特优势而受到广泛关注。

在应用微生物进行原位修复时,由于环境中土著微生物的多样性及污染成分的复杂性,筛选的功能菌株往往不能显现其特有的高效降解性能[5]。固定化微生物技术通过物理或化学方法将游离的微生物与特定的载体相结合,为微生物提供相对稳定的生存环境,减轻土著微生物带来的竞争压力,缓冲外界物质对细胞的毒害,从而达到强化降解的目的[6]。目前固定化微生物技术被广泛运用于污水中氨氮的去除,以及含酚废水、含油废水等高浓度有机废水的处理,并取得了良好效果[7],但固定化微生物技术在农药污染修复方面的研究相对较少。从已有的研究结果看,固定化载体和方式对污染物降解效果影响较大[8-10]。探讨针对二氯喹啉酸降解微生物的固定化载体及方式有助于微生物菌剂的应用开发。

国内关于二氯喹啉酸降解菌较早的报道为LÜ等[11]分离到的洋葱博克氏菌(Burkholderiacepacia),之后节杆属菌株(Arthrobactersp.)、博德特氏(Bordetellasp.)等多个属的二氯喹啉酸降解菌株被分离出来[12-13]。在进行农药污染水体或土壤原位修复时,由于环境条件复杂,实验室中筛选出的高效降解菌株不能适应自然环境或者不能达到实验室预期降解效果[14],因此采用一定的方式强化生物降解显得尤为重要。笔者从长期受污染的环境中分离到1株能降解二氯喹啉酸的细菌菌株,通过选取具有可生物降解性的麦秆和海藻酸钠为载体对游离菌株进行固定,考察了固定化菌剂在不同环境条件下的降解特性,同时研究了其对实际污水中二氯喹啉酸的去除效果,取得了较为满意的结果。

1 材料与方法

1.1 样品采集

土样采集于四川新津(33°25′17″ N,103°55′08″ E)长期施用二氯喹啉酸的土壤(试验田块),w(二氯喹啉酸)为19.4～25.3 mg·kg-1。

1.2 试剂与培养基

二氯喹啉酸(纯度w=99%)由四川省农资公司提供(购自国家农药中心),甲醇为色谱纯,购自天津科密欧化学试剂公司。

基础无机盐培养基(MSM):MnCl20.15 g,ZnSO445 mg,Na2MoO436 mg,NaNO34 g,FeCl30.10 g,K2HPO41.5 g,CaCl2·2H2O 0.01 g,KH2PO41.5 g,FeSO4·7H2O 0.04 g,MgSO40.2 g,(NH4)2SO41.0 g。LB培养基:酵母膏5 g,蛋白胨10 g,NaCl 10 g,pH值为7,H2O 1 L。固体培养基加入20 g琼脂。

1.3 菌株分离与纯化

称取5 g土样,置于ρ(二氯喹啉酸)为100 mg·L-1的无机盐液体培养基中,140 r·min-1、25 ℃摇床培养7 d。每隔7 d以10%接种量转接,采用梯度压力驯化法,ρ(二氯喹啉酸)按100 mg·L-1梯度递增,最终ρ(二氯喹啉酸)为500 mg·L-1。连续转接4次后检验降解效果。取富集液涂布在500 mg·L-1二氯喹啉酸无机盐培养基平板上,在25 ℃恒温箱培养,当培养基上长出单菌落后,挑取单菌落转接至含二氯喹啉酸的无机盐液体培养基试管中,140 r·min-1、25 ℃摇床培养,验证待测菌株的降解效果。取降解二氯喹啉酸效果良好的试管培养液划线纯化、镜检,斜面4 ℃保存。

1.4 菌株鉴定

1.4.1 菌株的生理生化特性

菌株形态观察、生理生化试验方法参见文献[15]。

1.4.2 DNA提取及PCR扩増

采用DNA提取试剂盒〔天根生化科技(北京)有限公司〕提取基因组DNA。16S rDNA基因的扩增引物5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′,5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。扩增体系:PCR Mix 10 μL,DNA模板1 μL,引物各1μL,超纯水补足30 μL。PCR扩增程序:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min;56 ℃退火1 min;72 ℃延伸2 min;30个循环;72 ℃延伸10 min。

1.4.3 克隆测序

将扩增产物纯化、回收,与pGM-T载体连接,然后转入大肠杆菌DH-5α感受态细胞,通过氨苄抗性及蓝白斑筛选阳性克隆,送至上海生工生物工程有限公司测序。所测得的序列用BLAST在GenBank寻找同源菌株及相关标准菌株的序列后,利用MEGA 6.0软件构建系统发育树。

1.5 固定化菌剂的制备

将去除顶端麦穗的麦秆清洗、烘干、打碎过180 μm孔径筛,称取1 g麦秆到含有20 mL无机盐培养基的锥形瓶,高温灭菌备用。将固体培养基上的单菌落转接至液体培养基中,140 r·min-1、25 ℃摇床培养至对数生长期后离心收集菌体,用无机盐液体培养基重悬,作为母液,取一定量加入含麦秆的培养基中,作为吸附载体。将海藻酸钠(SA)浸泡过夜,高温灭菌,冷却后与菌体以不同体积混合均匀,菌体是指经麦秆吸附后的菌体。随后将上述混合液滴入不同质量浓度的CaCl2溶液中,静置固化后用无菌水冲洗3次,置于4 ℃冰箱进行后续实验。以海藻酸钠质量分数、CaCl2质量分数、菌胶比和交联时间作为试验因素,采用正交试验法,设计4因素3水平的正交实验L9(3)4,各因子水平取值见表1。

表1 正交实验因素水平

Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

水平因素Aw(海藻酸钠)/%因素Bw(CaCl2)/%因素C菌体与海藻酸钠体积比因素D交联时间/h1521∶132632∶143741∶25

1.6 不同环境因子对二氯喹啉酸降解的影响

将二氯喹啉酸标准品(纯度w为99%)溶于甲醇并过滤,配制成不同浓度二氯喹啉酸溶液,按所需浓度添加到培养基中。按10%的体积比将固定化菌剂加入到含500 mg·L-1二氯喹啉酸的培养基中,140 r·min-1、25 ℃摇床培养,定时测定二氯喹啉酸含量。分别考察温度(15、20、25、30、35、40 ℃)、pH值(4、5、6、7、8、9)、外加碳源 (乳糖、淀粉、麦芽糖、葡萄糖、乙酸钠) 对降解效果的影响。样品在12 000 r·min-1条件下离心8 min(离心半径为3 cm),将上清液通过0.22 μm孔径滤膜后,采用高效液相色谱仪HPLC(Aglient 1200)测定二氯喹啉酸含量。分析条件:柱温40 ℃,流动相为V(甲醇)∶V(水)=90∶10的混合溶液,流速为0.5 mL·min-1,进样量为20 μL。色谱柱Inertsil ODS-2151-K(6 mm×150 mm)。所有实验重复3次,以接种灭活的菌体为对照。

1.7 固定化菌剂对污水中二氯喹啉酸的去除

污水采集于四川新津农业废水收集池,以氮、磷为主要污染物,并有Cr6+检出,ρ(二氯喹啉酸)为119.4 mg·L-1。在1 L水中加入φ为5%、10%、15%、20%、25%、30%的固定化菌剂，在温度为25 ℃、pH值为7、140 r·min-1条件下培养6 d,计算二氯喹啉酸的去除率。

1.8 数据分析

采用SPSS 21.0软件进行one-way ANONA分析,采用LSD法进行多重比较,采用Origin 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 菌株筛选及鉴定

经过梯度压力驯化,结合降解能力测定,从土壤中筛选获得1株具有降解二氯喹啉酸能力的细菌菌株,命名为PFS-4。菌株PFS-4为革兰阴性菌，短杆状;菌落形态为圆形、湿润、半透明、表面光滑,其他生理生化特性见表2。

表2 菌株PFS-4的生理生化特性

Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain PFS-4

测试项目结果测试项目结果革兰染色-淀粉水解试验+v-p测定-甲基红(M.R)试验-柠檬酸盐试验+明胶液化试验-产硫化氢试验-过氧化氢试验+硝酸盐还原试验+接触酶试验+乙酸盐-氧化酶+D-木糖-

+表示阳性；-表示阴性。

提取供试菌株的基因组DNA,扩增16S rDNA片段,T/A克隆后测序,获得1 419 bp的序列长度,登录号为KU974966。利用MEGA 6.0构建系统发育树(图1)。

图1 菌株16S rDNA系统发育图

结果表明,菌株PFS-4与假单胞菌属的施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)序列同源性为99%,结合生理生化特性,鉴定为施氏假单胞菌。Pseudomonassp.广泛存在于环境中,许多具有有机污染物降解能力的菌株已从不同环境中分离获得。

2.2 固定化菌剂制备条件的优化

为优化菌剂的固定条件,以w(海藻酸钠)、w(CaCl2)、菌胶体积比和交联时间为影响因素,设计了4因素3水平实验。从表3可见,各因素影响为:w(海藻酸钠)A>交联时间D>菌胶体积比C>w(CaCl2)B,即w(海藻酸钠)(SA)对二氯喹啉酸去除率影响最大,其次为交联时间,w(CaCl2)的影响最小。固定化菌剂制备的最优组合是A1B3C3D3,即:w(海藻酸钠)为5%,菌胶体积比为1∶2,w(CaCl2)为4%,交联时间为5 h。

表3 二氯喹啉酸降解率正交试验结果

Table 3 Orthogonal experiment results of quinclorac degradation

实验序号水平设置因素A因素B因素C因素D二氯喹啉酸降解率/%1111181.342122293.283133395.154212388.735223180.286231286.317313282.278321376.039332170.92

因素A、B、C、D分别为w(海藻酸钠)、w(CaCl2)、菌胶体积比和交联时间。

表4 二氯喹啉酸降解正交试验极差分析

Table 4 Analysis of quinclorac degradation rang based on orthogonal experiment

因素均值1/%均值2/%均值3/%极差R因素A89.9285.1176.4013.52因素B84.1183.1984.130.94因素C81.2284.3185.914.69因素D77.5187.2888.6411.13

因素A、B、C、D分别为w(海藻酸钠)、w(CaCl2)、菌胶体积比和交联时间。

2.3 菌株PFS-4的生长曲线及其对二氯喹啉酸的降解

为了使用生长旺盛期的菌株开展后续实验,将菌株PFS-4以φ为2%的量接种到ρ为500 mg·L-1的二氯喹啉酸培养基中,在温度为25 ℃、pH值为7、140 r·min-1条件下培养,测定其生长曲线以及对二氯喹啉酸的降解效果(图2)。经2 d培养,二氯喹啉酸降解率仅为7%,随着菌株进入对数生长期,生长量增大，降解率也随之增加,5 d后菌株开始衰亡,到6 d时菌株对二氯喹啉酸降解率为76%,菌株对二氯喹啉酸的降解率与菌株生长量在1～5 d时呈显著正相关。

图2 菌株PFS-4的生长曲线及对二氯喹啉酸的降解

2.4 温度对固定化菌株降解二氯喹啉酸的影响

分别以φ为10%和2%的量接种固定化菌剂和游离菌体至含500 mg·L-1二氯喹啉酸的培养基,考察温度对菌剂降解二氯喹啉酸的影响。从图3可见,固定化菌剂在前2 d降解量较低,各温度下降解率无显著差异(P>0.05)。

图3 温度对固定化菌剂和游离菌体降解二氯喹啉酸的影响

3 d后,随着生长量增加,降解作用也随之加强,最后趋于稳定,与游离菌株PFS-4生长曲线一致,说明菌体经麦秆-海藻酸钠固定后对菌株生长特性影响小。总体而言,固定化菌剂在15～35 ℃范围时,具有较稳定的降解率。游离菌体在温度低于或高于30 ℃时,降解率迅速下降,在15和40 ℃时降解率分别为21.1%和17.8%，适应温度范围窄,而固定化菌剂适应温度的范围较宽。此前相关研究中分离到的二氯喹啉酸降解菌在30～37 ℃范围内具有较高降解能力,但对温度敏感,温度变化会引起降解率的大幅变化[12,16-17]。因此,固定化处理可增加菌种对温度的适应能力,将有利于复杂环境中二氯喹啉酸的生物降解。

2.5 pH值对菌剂降解二氯喹啉酸的影响

分别以φ为10%和2%的量接种固定化菌剂和游离菌体至含二氯喹啉酸(500 mg·L-1)的无基盐培养基,在温度为30 ℃、140 r·min-1条件下,考察不同pH值对菌剂降解二氯喹啉酸的影响。由图4可知,固定化菌剂及游离菌在pH值为7时降解率最高,分别为92.3%和79.7%。当pH值从7降到4时,固定化菌剂降解率下降66%,游离菌体下降78%;当pH值从7到9时,固定化菌剂降解率下降18%,游离菌体下降44%。pH值的改变对菌体的降解产生了显著抑制作用(P<0.05),但固定化菌剂抵抗酸碱变化的能力强于游离菌体,这与此前关于固定化菌剂相关研究结果一致[6]。

直方柱上方英文小写字母不同表示

2.6 碳源对菌剂降解二氯喹啉酸的影响

在此前的研究中发现外加碳源对固定化菌剂降解有机物效果产生较大影响[18],因此选取5种碳源考察了其对菌剂降解二氯喹啉酸(500 mg·L-1)的影响。如图5所示,各碳源的添加对固定化菌剂降解均具有促进作用，但效果不显著(P>0.05),乙酸钠的作用最强,添加后对二氯喹啉酸的降解率也仅比对照增加不到2%。而对于游离菌株,乙酸钠、葡萄糖、乳糖以及麦芽糖显著增加了菌体的降解能力(P<0.05),仅淀粉对游离菌株的降解产生了抑制作用,这与此前郭雅妮等[19]关于淀粉对菌株降解聚乙烯醇(PVA)的研究结果一致,分析原因可能是由于淀粉属于高生物降解性物质,很容易被降解,大量菌体随着时间增长迅速,产生营养竞争导致菌体量下降。外加碳源对固定化菌剂降解能力的影响较小,而对于游离菌体影响较大,推测可能与载体自身含碳量较高从而导致外加碳源对强化作用较弱有关。岳黎等[20]关于碳氮源对苯酚降解菌作用的研究中发现葡萄糖的添加抑制了降解效果,说明碳源对降解菌降解效果的影响除了与碳源类型有关外,还与菌株特性有关。

直方柱上方英文小写字母不同表示

2.7 菌剂对农田污水中二氯喹啉酸的去除

为考察游离菌体及固定化菌剂对实际污水中二氯喹啉酸的去除效果,从农业污水收集池取水样,测定水样中ρ(二氯喹啉酸)为119.4 mg·L-1,pH值为7.8。调整pH值到7.0,加入不同量的游离菌以及固定化菌剂,室温培养6 d后测定去除率。如图6所示,不同投加量的固定化菌剂对二氯喹啉酸的去除率在64.7%以上。而游离菌体的去除率约为固定化菌剂去除率的50%。随着投加量的增加,降解率有增加趋势,但当投菌量达到一定值后,降解率开始下降,这是由于在驯化过程中过量的菌体增殖形成了营养竞争,导致降解率下降。固定化菌剂对实际污水中二氯喹啉酸的去除率低于在实验室条件下相同浓度的二氯喹啉酸模拟污水,这与实际污水中复杂的化学成分及微生物对营养的竞争有关。

固定化载体和高效降解菌是固定化微生物技术的2个重要支撑,而固定化方式是协调 2个支撑的关键媒介[6],这3者缺一不可。麦秆作为植物残体,含有丰富的C、N等营养元素,对微生物和酶都有很强的亲和力[7],因此具有良好前景。

直方柱上方英文小写字母不同表示同一菌体

3 结论

(1)从长期施用二氯喹啉酸的土壤中分离到1株能降解二氯喹啉酸的菌株PFS-4,经生理生化及分子生物学鉴定为施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri),在25 ℃、pH值为7条件下,经6 d培养后,对500 mg·L-1二氯喹啉酸降解率达76%以上。

(2)采用麦秆-海藻酸钠对菌株PFS-4进行固定,固定化菌剂制备的最优组合为:w(海藻酸钠)为5%,菌胶体积比为1∶2,w(CaCl2)为4%,交联时间为5 h。

(3)固定化菌剂在温度为30 ℃、pH值为7的最适条件下,对500 mg·L-1二氯喹啉酸降解率达92.3%,强化了游离菌体的降解效果,而且对温度及酸碱的耐受强度大于游离菌体。

(4)固定化菌剂对未经处理的农业污水中二氯喹啉酸去除率在64%以上,显著高于游离菌的去除率(P<0.05)。

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(责任编辑： 陈 昕)

Isolation,Immobilization and Characterization of Quinclorac-Degrading Strain Pseudomonas stutzeri PFS-4.

ZHANG Ke1, WU Yi-qi2, CHEN Wei1, GE Sang2, CHEN Jia1, LUO Hong-bing1

(1.College of Civil Engineering, Sichuan Agricultural University, Dujiangyan 611830, China;2.School of Municipal and Environmental Engineering, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, China)

Using quinclorac as carbon source, one strain, named PFS-4, was isolated from long-term contaminated soil. Strain PFS-4 was identified asPseudomonasstutzeribased on physiological and biochemical characteristics and 16S rRNA sequence analysis. PFS-4 immobilization condition was optimized by orthogonal experiment, and then the effects of different temperature, initial pH, carbon and nitrogen sources on the degradation of quinclorac by the immobilized bacteria were examined. The performance of free bacteria and immobilized bacteria in actual wastewater were also detected. The results show that the optimal conditions for immobilization were as follows: alginate concentration 5%, calcium chloride 4%, bacteria cement ratio 1∶2, crosslinking time 5 h. The immobilized bacteria could effectively degrad 92.3% of quinclorac (500 mg·L-1) after 5 d inoculation at the condition of 30 ℃ and pH 7.0. The results also revealed that the degradation rate decreased when treating actual wastewater. The degradation rate of free bacteria was significantly inhibited (P<0.01)when treating wastewater, on the contrary,immobilized bacteria were less affected and the removal rate remained above 64%. Therefore, wheat-straw adsorption-sodium alginate immobilized bacteria can be applied in quinclorac biodegradation treatment because of its good buffering to adverse circumstances.

quinclorac； wheat straw-SA carrier； immobilization； biodegradation

2015-11-11

国家自然科学基金(51278318);四川省科技支撑计划(2013SZ0103,2014NZ0044)

X592

A

1673-4831(2016)06-1018-06

10.11934/j.issn.1673-4831.2016.06.024

张可(1982—),女,四川成都人,讲师,硕士,主要从事环境微生物及市政污水处理研究。E-mail: zhangke@sicau.edu.cn

① 通信作者E-mail: luohongbing66@163.com