响应面法优化蛋壳膜中硫酸软骨素提取工艺

刘恒洋，尹玉鑫，郭晓徐，宋绍奇，刘美玉

（1.河北工程大学生命科学与食品工程学院，河北邯郸 056038；2.邯郸市天然产物与功能性食品开发重点室验室，河北邯郸 056038）

0 引言

随着人们生活水平的提高，禽蛋产品在世界范围内的消费量也不断增多，大量废弃蛋壳随之产出，从而造成了极大的环境污染和资源浪费[1]，事实上，蛋壳中含有大量可利用资源，其中含有的钙类物质、活性肽、蛋白质等成分，具有很高的利用价值[2]。近年来，对于废弃鸡蛋壳的研究逐渐加深，人们逐渐重视对此资源的开发与利用[3]，此项研究的开展不但能改善日益严重的环境问题，而且变废为宝，提高了鸡蛋的附加值，推动了鸡蛋壳深加工产业的发展，可谓一举两得。

硫酸软骨素呈白色粉末，无臭、有引湿性、遇水有粘黏性，广泛存在于动物组织、细胞表面与细胞基质之间[4]。硫酸软骨素的用途广泛，可作为膳食保护剂，起到保护关节等软骨组织的效果，可以很好地缓解关节不适等症状，治疗骨关节炎等疾病。同时，硫酸软骨素具有抗凝血、镇静、抗肿瘤、抗氧化、调节血脂等功能，因此硫酸软骨素被广泛应用于食品、医疗、化妆品等行业中。近年来，对于硫酸软骨素的需求量不断增加[5-7]，以硫酸软骨素作为研究对象的产品市场前景广阔。

目前，我国硫酸软骨素主要提取工艺为从动物软骨组织中进行提取，通过高温蒸煮的办法，使动物结缔组织破坏，通过碱解法或酶解法从中进行硫酸软骨素的提取，也可以通过微生物发酵进行硫酸软骨素的提取。除此之外，硫酸软骨素也可以从蛋壳膜中进行提取，相比与从动物软骨组织中提取，蛋壳膜中提取硫酸软骨素不仅可以有效地利用我国的蛋壳资源，达到真正意义上的废物利用，蛋壳膜获取方式简单，且原材料产量极大，也能直接增加硫酸软骨素的产量。目前，从蛋壳中提取硫酸软骨素的方法很多，常见的方法有碱提取法、碱酶法、碱盐法。这些工艺提取的硫酸软骨素，在提取率上相差不大。刘涛等人[8]通过碱盐法从蛋壳膜中提取硫酸软骨素，提取率为74%。刘宁等人[9]通过酶提取法硫酸软骨素，利用木瓜蛋白酶水解蛋壳质的性质，将硫酸软骨素从糖蛋白中分离出来，从而进行硫酸软骨素的提取，该工艺的提取率为75.31%，略高于碱盐法提取率。刘国庆等人[10]利用稀碱法处理蛋壳膜，并通过双酶法进行提取，采用胰蛋白酶和胃蛋白酶相结合的提取工艺，该工艺下硫酸软骨素的提取率为76%。对比其他提取工艺，碱盐法提取硫酸软骨素工艺相对简单，且提取率并不低，与酶法提取硫酸软骨素相比，在提取成本上要大大减少，较适合批量生产使用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸡蛋壳，收集于河北省邯郸市美食林工业园；氯化钠、氯化钙、盐酸、氢氧化钠、葡萄糖标品、碳酸钙、无水碳酸钠等，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

电子分析天平，上海精密科学仪器有限公司产品；80 目标准分样筛，浙江上虞市道墟张兴纱筛厂产品；摇摆式中药粉碎机，新昌县德科机械有限公司产品；电热鼓风干燥箱，上海博珍仪器设备制造厂产品；高速冷冻离心机，广东佛衡仪器有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 硫酸软骨素提取率测定方法

（1） 多糖标准曲线的制作。用电子天平准确称取标准葡萄糖20 mg，将称取好的葡萄糖加入到的蒸馏水中，装入到500 mL 的容量瓶中，用胶头滴管滴至刻度线，定容摇匀好备用。采用移液枪分别吸取0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 mL 的标准溶液至试管中，并用蒸馏水补至2.0 mL。依次加入苯酚溶液1 mL，浓硫酸5 mL。另做一个2 mL 的蒸馏水重复上述显色操作做空白对照试验；将上述制得结束试管进行摇匀，静置30 min后，放入紫外分光光度仪中，于波长490 nm 处测得吸光度。以多糖质量浓度作为横坐标，吸光度作为纵坐标绘制标准曲线。

（2） 硫酸软骨素含量测定。采用移液枪定量吸取250 μL 待测液体，用蒸馏水补至2 mL，加入1 mL 的苯酚及5 mL 的浓硫酸，并进行充分摇匀，将其静置30 min，移至紫外分光光度仪中，于波长490 nm 处测其吸光度，将所测得的吸光值，代入标准曲线中，通过换算便可得到硫酸软骨素的含量。

（3） 硫酸软骨素提取率的计算。

式中：W——硫酸软骨素的提取率，%；

C——将待测样品代入吸光值中测得的多糖含量，g；

V1——定容液体的体积，mL；

V2——测量时所取液体的体积，mL；

M——蛋壳膜中总糖含量，g。

1.3.2 单因素试验设计

定量称取1 g 蛋壳膜（精确到0.01 g）。在多组预试验的基础上选取料液比、提取温度、碱盐比、提取时间4 个因素进行单因素试验。探究不同因素对蛋壳膜中硫酸软骨素提取率的影响。先设置料液比为1∶13，反应温度为50 ℃，碱盐比为3∶1，反应时间为5 h 作为每个因素除自身外的固定值，再设计料液比、反应温度、碱盐比和反应时间。

单因素与水平设计见表1。

表1 单因素与水平设计

1.3.3 响应面试验设计

根据单因素的试验结果，设计四因素三水平的响应面试验，将料液比、反应温度、碱液浓度、反应时间4 个影响因素较大的因子，利用响应面试验优化从蛋壳膜中提取透明质酸的最佳工艺参数，以透明质酸的提取量作为参考指标进行分析。

响应面分析因子水平编码见表2。

表2 响应面分析因子水平编码

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 不同料液比对硫酸软骨素脱钙率的影响

暂定碱盐比为3∶1，提取温度为50 ℃，提取时间为6 h，探究不同料液比对硫酸软骨素提取率的影响。

料液比对硫酸软骨素提取率的影响见图1。

图1 料液比对硫酸软骨素提取率的影响

由图1 可知，在料液比为1∶13～1∶15 时，随着料液比的上涨，硫酸软骨素的提取率也在不断升高；在料液比为1∶15 时，硫酸软骨素的提取率达到最高点，此时的提取率为46%，因为随着料液比的增加，蛋壳膜中的水分也不断增多，碱试剂与盐试剂对蛋壳膜的接触面积增大，从而加速了硫酸软骨素的提取；料液比为大于1∶15，硫酸软骨素的提取率趋势趋于平缓，并无显著的提升，分析其原因，1∶15 的料液比基本可使蛋壳膜中的硫酸软骨素的提取进行反应完全，因此料液比为1∶15 之后，再次提高料液比对硫酸软骨素的提取率影响不大。综合考虑，选择最佳料液比为1∶15 即可满足试验需要。

2.1.2 不同提取温度对硫酸软骨素提取率的影响

固定料液为1∶15，暂定碱盐比为3∶1，提取时间为6 h，探究不同提取温度对硫酸软骨素提取率的影响。

提取温度对硫酸软骨素提取率的影响见图2。

图2 提取温度对硫酸软骨素提取率的影响

由图2 可知，随着提取温度从30 ℃升高到60 ℃，硫酸软骨素的提取率也随着温度的升高而增长，在提取温度为60 ℃时，此时硫酸软骨素的提取率达到最高，为46.5%。因为随着温度的提升，溶液中的反应速率也在加快；提取温度为60 ℃为最佳反应温度，此时硫酸软骨素的提取率最高；提取温度60 ℃之后，再次升高温度，硫酸软骨素的提取率趋于平缓，并略有降低态势。这是由于过高的提取温度可能会导致蛋壳膜的性质发生变化，从而不利于硫酸软骨素的提取。综合考虑，选择提取温度为60 ℃作为蛋壳膜中提取硫酸软骨素的最佳温度。

2.1.3 不同碱盐比对硫酸软骨素提取率的影响

固定料液比为1∶15，提取温度为60 ℃，暂定反应时间为6 h，探究不同碱盐比对硫酸软骨素提取率的影响。

碱盐比对硫酸软骨素提取率的影响见图3。

图3 碱盐比对硫酸软骨素提取率的影响

由图3 可知，随着碱盐比的升高，硫酸软骨素的提取率呈现先升高再降低的趋势。碱盐比从4∶1增加到6：1，硫酸软骨素的提取率逐渐升高，在碱盐比为6∶1 时硫酸软骨素提取率达到最高值为53.5%，因为适当的提高碱浓度会促进碱解的迅速进行，加速硫酸软骨素的提取；当碱盐比达到7∶1后，硫酸软骨素的提取率升高不显著，且有降低的趋势，过高的碱盐比的加入，会对蛋壳膜造成一定程度的破坏，导致蛋壳膜的性质发生变化，从而影响硫酸软骨素的提取。综合考虑，选择碱盐比6∶1为最佳碱盐比。

2.1.4 不同提取时间对硫酸软骨素提取率的影响

固定料液比为1∶15，提取温度60 ℃，碱盐比为6∶1，探究不同提取时间对硫酸软骨素提取率的影响。

提取时间对硫酸软骨素提取率的影响见图4。

图4 提取时间对硫酸软骨素提取率的影响

由图4 可知，随着提取时间的增加，硫酸软骨素的提取率呈现逐渐增长的趋势，提取时间从2 h 延长到8 h 的阶段，硫酸软骨素的提取率显著提高，在提取时间为8 h 时，此时的提取率基本达到最高，为56.5%。分析其原因，适当延长提取时间会使蛋壳膜中的硫酸软骨素碱解更为完全，因此硫酸软骨素的含量也是显著提升，8 h 基本上可以使其完全提取，此时延长反应时间对硫酸软骨素的提取率影响不大，且过长的提取时间有可能会造成微生物的污染，且造成试验时间的浪费。综合考虑，确定提取时间为8 h 为硫酸软骨素的最佳提取时间。

2.2 响应面试验结果分析

在单因素试验结果的基础上，利用Design Expert 10.0.8 响应面软件设计Box-behnken 试验，测定硫酸软骨素提取率（Y）。

响应面试验设计及结果见表3。

表3 响应面试验设计及结果

根据单因素的试验结果，选取料液比（A），提取温度（B），碱盐比（C），提取时间（D） 作为响应因素，筛选蛋壳膜中提取硫酸软骨素的最佳工艺条件，利用响应面法对其进行优化试验，采用Design Expert 10 设计四因素三水平的响应面试验。试验结果对蛋壳膜中提取硫酸软骨素的数据进行多元回归拟合，结果表明各因素与响应面的二次多项回归模型为：

根据p 值大小进行判断是否显著，当p＜0.05 为显著，p＜0.01 为极显著。

响应面试验结果方差分析见表4。

表4 响应面试验结果方差分析

由表4 可知，蛋壳膜中提取硫酸软骨素的提取率为响应值时，该模型p＜0.01，表示该二次项方程为极显著；失拟项p=0.145 4＞0.05，模型失拟项不显著，失拟项不显著表示该二次项模型拟合较好，模型决定系数R2为0.984 3，表示该二次项模型可以解释98.43%的试验数据，试验拟合较好，且误差较小，R2Adj为0.968 6，两者数值较高，且较为接近，表明模型有较好的使用性和通用性，该模型可以很好地反映响应值硫酸软骨素提取量的变化，可采用该模型对蛋壳膜膜中提取硫酸骨素进行实际分析；通过变异（CV） 可以反映出模型的可信度，变异系数的值越低，表示模型的可信度越高，该试验的变异系数为1.58%，表示该模型较为可信。各因素对蛋壳膜中提取硫酸软骨素的影响由高到低分别是A＞D＞C＞B，即料液比＞提取时间＞碱盐比＞提取温度。

各因素交互作用的响应面与等高线图见图5。

由图5 响应面3D 图可直观描述回归模型，等高线图形越趋近与圆形表示2 个自变量的交互作用越弱，等高线越趋近与椭圆形表示2 个变量的交互作用越强。各个因素之间的交互作用对蛋壳膜中提取硫酸软骨素影响强弱排序为AC＞CD＞BC＞AB＞BD＞AD，即料液比与碱盐比之间的交互作用＞碱盐比与提取时间之间的交互作用＞提取温度与碱盐比之间的交互作用＞料液比与提取温度之间的交互作用＞提取温度与提取时间之间的交互作用＞料液比与提取时间之间的交互作用。相对而言，试验中料液比（A） 与碱盐比（C） 交互作用曲面最为陡峭，表明在提取硫酸软骨素试验中，料液比的增加对碱盐比的影响显著（p＜0.01）。AC 的交互作用达到极显著水平（p＜0.01），CD 的交互影响达到显著水平（p＜0.05）。

由回归模型预测和分析得出蛋壳膜中提取硫酸软骨素最佳工艺为料液比1∶15.408，提取温度59.476 ℃，碱盐比6.014∶1，提取时间8.146 h，此时的硫酸软骨素的提取率可达76.67%。

2.3 验证试验

考虑到实际情况，粗蛋壳膜为1 g 时，选取料液比为1∶15.5，提取温度为60 ℃，碱盐比为6∶1，提取时间为8 h，在此条件下，硫酸软骨素的提取率可达76.5%，理论值与实际值相差不大，拟合较好，相对误差＜0.5%，该验证试验结果表明采用此响应面法得到的工艺参数真实可信。

3 结论

以蛋壳膜为原材料，采用碱盐法进行提取蛋壳膜中的硫酸软骨素，在单因素试验的基础上设计四因素三水平的响应面试验，优化提取硫酸软骨素的工艺参数，以硫酸软骨素的提取量作为指标，以苯酚硫酸法作为检测方法，从而得到蛋壳膜中提取硫酸软骨素的最佳工艺为蛋壳膜1 g，料液比1∶15.5，提取温度60 ℃，碱盐比6∶1，提取时间8 h，在最佳工艺的条件下提取硫酸软骨素，提取率可达76.5%。该试验为蛋壳膜的综合利用提供了有效参考，为工业化生产提供了试验数据。