大黄鱼中大肠菌群测量不确定度评定

林 毅，吴文学，张悦琳，朱品玲

（1.福州海关技术中心，福建 宁德 352100；2.南平市食品药品检验检测中心，福建 南平 353000）

大肠菌群是指在一定条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌[1]。大肠菌群与菌落总数、霉菌等常作为评价食品卫生指标之一[2-4]，大肠菌群包括大肠杆菌和产气杆菌等，这些细菌寄居于人及恒温动物肠道内，随大便排出体外。食品中的大肠菌群常作为食品受粪便污染程度指标，具有广泛的意义。

ISO/IEC 17025 :2017[5]、 《CNAS-CL01-A001 :2022》[6]等规范性文件中对测量不确定度做出要求，如《CNAS-CL01-A001 :2022》 条款7.6《测量不确定度的评定》中规定“对于定量（平板计数法） 微生物检测方法实验室应分别进行不确定度评定”，对微生物定量检测方法测量不确定度要求进一步加强。不确定度是根据所用到的信息，表征赋予被测量值分散性的非负参数[7]，不确定度由一些不可避免因素组成，其数值代表检测结果不能肯定程度的大小，不确定度越小，测量值与真实值越接近。对大肠菌群检测结果进行不确定度分析是实验室质量控制的重要组成部分，使实验室检测结果更可靠，更具科学性、公正性。

根据同一试验人员在相同条件下对1 份大黄鱼样品重复检测18 次，依据JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》[7]、RB/T 151—2016《食品微生物定量检测的测量不确定度评估指南》[8]、GB/T 27418—2017《测定不确定度评定和表示》[9]、CNASCL01-G003《测量不确定度的要求》[10]、GB/T 27420—2018《合格评定 生物样本测量不确定度评定与表示应用指南》[11]，对检测过程中的不确定度分量进行统计分析，对检测数据进行不确定度分析。

1 材料与方法

1.1 试验方法

检测依据GB 4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验 大肠菌群计数》[1]第二法 大肠菌群平板计数法进行测试。样品处理：GB/T 4789.20—2003《食品卫生微生物学检验 水产食品检验》[12]。

1.2 试验材料

样品：大黄鱼（人工污染，添加大肠埃希氏菌标准菌株：ATCC 25922）；NaCl（分析纯），国药集团化学试剂有限公司提供；VRBA 琼脂、BGLB 肉汤，北京陆桥技术股份有限公司提供。试剂耗材经验收合格且在有效期内。

1.3 试验步骤

称取25 g 样品置于225 mL 生理盐水中，充分均质，制成1∶10 的样品稀释液。

用1 mL 无菌移液器吸取1∶10 样品匀液1 mL，沿管壁缓缓注入盛有9 mL 生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），混合均匀，制成1∶100 的样品匀液。根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10 倍递增系列样品稀释液。

选择2～3 个连续的适宜稀释度样品均液，每个稀释度接种2 个平皿，每皿1 mL 样品均液，同时设置空白对照，每皿倾倒15～20 mL VRBA 培养基，旋转平皿使培养基与样品充分混匀。在培养基凝固后加入3～4 mL VRBA 覆盖平板表层，翻转平板，置于（36±1） ℃下培养18～24 h。

选取菌落数在15～150 CFU 的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。

从VRBA 平板上挑取10 个不同类型的典型和可疑菌落，少于10 个菌落的挑取全部典型和可疑菌落。分别移种于BGLB 肉汤管内，（36±1） ℃下培养24～48 h，观察产气情况。凡BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。

2 数学模型

式中：Y——样品中的大肠菌群菌落数，CFU/g；

N——计数稀释度的大肠菌群菌落数，CFU/g；

V——所加样品稀释液的体积，mL；

D——计数样品稀释液的稀释倍数；

A——计数稀释度典型与可疑大肠菌群菌落数，CFU/g；

B——被证实的大肠菌群阳性比率，%。

此次不确定度评定添加大肠埃希氏菌标准菌株，样品在VBRA 平板上生长的典型菌落、可疑菌落均为大肠菌群，因此可不做确认试验；同时，根据GB 4789.3—2016 每一稀释度平皿加入的稀释液体积都为1 mL，因此上述公式（1） 可简化为：

3 不确定度来源

测量不确定度来源于对检测结果产生影响的所有过程分量，其中对在规定测量条件下测得的量值统计分析得到测量不确定度分量评定称为测量不确定度的A 类评定，用不同于测量不确定度A 类评定的方法对测量不确定度分量进行的评定称为测量不确定度的B 类评定[7]。其中，A 类不确定度来源于重复检测操作过程，B 类不确定度来源于样品处理、稀释、加样体积等过程。

测量不确定度来源分析见表1。

表1 测量不确定度来源分析

4 不确定度评定

4.1 样品重复检测引入的不确定度

在一定条件下，由同一个试验人员对同一样品进行检测，为提高自由度，对同一样品重复测量18 次。

同一样品18 次重复测量结果见表2。

表2 同一样品18 次重复测量结果

由表2 中检测结果可知，检测结果相差较大，发散性大，如果直接根据检测结果计算得到的标准偏差评定相应的测量不确定度，其样本不确定度较大，不合理，因此将检测结果取对数值[13-14]，计算样本的试验标准偏差并根据贝塞尔公式得到样本平均值的标准偏差，即样品A 类标准不确定度。

n——样品检测次数。

4.2 样品处理引入的不确定度

4.2.1 天平引入的不确定度

根据GB 4789.3—2016[1]，样品处理：25 g 样品加入225 mL 生理盐水（稀释液） 中制成1∶10 稀释液。使用天平称取25 g 样品，根据天平检定证书在0～500 g 内最大允许误差为±0.05 g，取均匀分布，则天平称量引入的标准不确定度为：

称取25 g 样品引入的相对标准不确定度为：

4.2.2 量筒引入的不确定度

样品处理过程使用量程为250 mL 的量筒量取225 mL 生理盐水，根据JJG 196—2006[15]，250 mL量筒的最大允许误差为±2.0 mL，取均匀分布，得250 mL 量筒引入的标准不确定度为：

量取225 mL 生理盐水引入的相对标准不确定度为：

4.2.3 样品处理引入的相对标准不确定度

4.3 样品稀释引入的不确定度

根据GB 4789.3—2016[1]，样品稀释：取1 mL 的1∶10 稀释液加入9 mL 生理盐水中制得1∶100 稀释液。该过程用到1 mL，10 mL 量程移液枪分别移取1 mL，9 mL 液体，根据JJG 646—2006[16]，1 mL，10 mL 移液枪允许误差±0.01 mL，±0.06 mL，取均匀分布，则1 mL，10 mL 移液枪引入标准不确定度分别为：

1 mL，10 mL 移液枪引入的相对不确定度分别为：

样品稀释引入的相对不确定度：

4.4 样品加样体积引入的不确定度

根据GB 4789.3—2016，接种时每个稀释度接种2 个无菌平皿，每个平皿接种1 mL。根据JJG 646—2006[16]，1 mL 移液枪允许误差为±0.01 mL，取均匀分布，标准不确定度及相对标准不确定度参考4.3 中V2，其中标准不确定度为：

样品加样体积引入的相对不确定度为：

4.5 相对合成标准不确定度及扩展不确定度

4.1～4.4 中引入的不确定度因素都是相互独立的，则合成标准不确定度为：

根据JJF 1059.1—2012 附录B，取置信概率p=95%，自由度v=18-1=17，查表得k=tp（v）=t95（17）=2.11，则扩展不确定度为：

5 结论

从上述不确定度计算的结果可以看出，上述分量对不确定度均产生影响，但部分分量影响较小，可忽略不计。其中，B 类不确定度（样品处理、稀释、加样体积） 对合成不确定度贡献较小，A 类（重复测量） 不确定度分量较大，因此为方便测量不确定度评定，日常评定可只对A 类不确定度进行评定即可。

不同于化学微量检测的样品均匀性良好，微生物检测样品均匀性差，微生物检测以宏观为主、样品代表性差、微生物分布不均及不同菌落间互生或拮抗等作用给微生物检测带来很多不确定性，都为微生物检测测量不确定度评定带来困难[17-18]。

研究过程中A 类测量不确定度数据来源为同一样品同一条件下重复测量所得，虽可用贝塞尔公式直接计算，但日常检测过程中多为不同样品，其检测结果发散性大，建议对不同属性样品进行测量不确定度评价，充分考虑样品种类、性质带来的差异。

除了提到、计算的不确定度分量外，微生物测量不确定度分量来源还有样品属性（样品性质、均一性）、培养基（品牌、配置时间、灭菌温度及时间、pH 值）、微生物培养环境（温度、湿度、时长） 等，这些分量复杂且不易计算，对不确定度影响较小，不予考虑。实验室在日常检测过程中需注意这些分量对测量不确定度的影响，建议制订作业指导书、规程等来规范操作减少此类分量的影响。