利用鳗鲡脊骨制备鳗骨肽钙及其乳液的研究

魏梦园，林 蓉，林 靖，施奕诗，骆豫洋，梁宇婷，柯 政，闫惠琳，石林凡，2，翁武银，2，任中阳，2

（1.集美大学海洋食品与生物工程学院，福建厦门 361021；2.厦门市海洋功能食品重点实验室，福建厦门 361021）

福建省鳗鲡（Anguilla japonica） 产业，始于20 世纪70 年代末期，作为中国最早开始鳗鲡产业的省份，历经40 余年已形成鳗鲡养殖、生产、加工及销售贸易于一体的产业体系[1]。福建鳗鲡产业现已带动动保产品生产与饲料、配套渔具、烤鳗加工、鳗鲡苗种及活鳗烤鳗贸易及技术服务等相关行业发展。无论是从养殖技术、生产规模，还是产品品质，福建的鳗鲡产业都位居全国首位。福建已经发展成为中国鳗鲡产业的重要基地。目前，福建省鳗鲡加工量约15 万t[2]。然而，近年来鳗鲡产业发展面临一些问题，如整个产业存在产能过剩、效益下降、副产物利用率低等。烤鳗出口受阻也开始逐渐突显，以外贸出口为主的中国鳗鲡产业遭受重创，销量不及往年50%，产业面临历史上最严重危机，出口转内销变为大势所趋[3]。

烤鳗是中国沿海省份大宗出口的高营养和高经济价值水产制品，但烤鳗加工过程中都会产生大量的下脚料鱼头、鱼皮、鱼骨等副产物。这些副产物含有丰富的蛋白质、磷脂质、软骨素、维生索、矿物质、牛磺酸等功能性成分[4]，其中鳗鲡骨含有蛋白质16.63%，水分46.36%，灰分8.12%，脂肪29.7%，同时含有丰富的氨基酸（约12%） 和钙（高达20%以上）[5]。已有研究表明，以废料鳗骨为原料，采用先进的物化和生物技术将骨肉分离后对鱼肉和鱼油进行深加工，并将鱼骨制成鳗钙口含片系列产品[6]。另有试验利用有机溶剂法，薛宇航等人[7]采用双酶法对鳗骨中所含的骨油进行抽提以利用鳗骨资源提取和精制鱼油。然而，并不能使鳗鱼骨得到充分利用，为此需要找到合适的用途才能有效解决其环境污染和利用率的问题。因此，如何有效开发鳗骨肽钙制品，成为鳗鲡加工副产物高值化利用研究的一个重要方向。

目前，螯合钙的制备方法主要有酸水解法、碱水解法、生物酶解法及高能湿法球磨。采用酸碱水解法制备多肽螯合物成本高，存在化学残留等安全性问题，而生物酶解法，具有条件温和、安全性高、成本低、水解过程容易控制等优点。因此，在制备多肽螯合物过程中大多采用生物酶解法。然而，肽钙制品开发受稳定性差、生物利用度低等限制。从乳液递送缓释的角度出发，开发肽钙乳液制品成为一种可能。

为提高鳗鲡加工遗留下脚料副产物的利用率，解决钙元素缺乏及其生物利用度低等问题，以烤鳗下脚料鳗鲡脊骨为原料，结合现有肽钙螯合物和蛋白质递送体系利用现状，采用酶法水解制备鳗骨肽钙，进一步开发鳗骨肽钙乳液[8]。一方面，可实现鳗鲡加工副产物中鳗骨的高值化利用，改善鳗骨肽钙的生物利用度；另一方面，利用肽螯合钙形成的有机钙可以促进钙吸收[9]，利用肽螯合钙制成的产品可用于补充人体所需的钙，促进骨骼的健康发育，增加骨密度并能预防神经和肌肉疾病[10]，也为肽螯合钙这一新型补钙制剂的开发提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试验原料

冷冻鳗鲡脊骨，水产品加工实验室提供，于-20 ℃条件下冻藏至使用。

1.2 试验试剂与仪器

1.2.1 主要试验试剂

氢氧化钠（≥96%）、盐酸（36%～38%）、异丙醇（≥99.7%）、无水碳酸钠（≥99.8%）、酒石酸钾钠（≥99.0%）、二水合氯化钙（≥98%），均为分析纯，西陇科学股份有限公司提供；酸性蛋白酶（BR，70 万U/g）、中性蛋白酶（BR，10 万U/g）、福林-酚试剂（BR），上海麦克林生化科技有限公司提供；无水硫酸铜（≥99.0%），天津市光复科技发展有限公司提供；碱性蛋白酶（BR，10 万U/g），南宁庞博生物工程有限公司提供。

1.2.2 试验仪器

FE20K 型pH 计，梅特勒- 托利多有限公司产品；Avanti J-26S 型高速冷冻离心机，美国Beckman公司产品；CT15RE 型台式冷冻离心机，日本株式会社日立制作所产品；FD-1A-50 型真空冷冻干燥机，北京博医康仪器有限公司产品；UV-8000A 型紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司产品；FA2104 型电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；HZFA3000 型电子天平，福州华志科学仪器有限公司产品；RH Basic 型磁力搅拌器，德国IKA 公司产品；HH-4 型数显恒温水浴锅，金坛市白塔新宝仪器厂产品；FSJ-A05N6 型粉碎机，广东小熊电器股份有限公司产品；MX-S 型涡旋混匀仪，北京大龙兴创实验仪器有限公司产品。

1.3 鳗骨粉末制备

根据孙乐常等人[11]的方法有所改动。将鳗鲡脊骨切段，长度小于5 cm，加水清洗去除血污内脏等杂质。清洗后的骨段加入料液比1∶10（W/V） 的浓度为0.1 mol/L NaOH 溶液，于4 ℃下缓慢搅拌处理24 h，每隔6 h 更换一次处理液。处理结束后，用蒸馏水反复洗涤鳗鲡脊骨骨段，直至洗涤水的pH 值呈中性。由于鳗鱼油脂较多，碱液处理后用料液比1∶5，质量分数为10%的异丙醇4 ℃下缓慢搅拌脱脂处理24 h，每隔12 h 更换一次处理液。脱脂结束后将鳗鲡脊骨取出蒸馏水冲洗3～4 次、沥水后冷藏，冻干。利用粉碎机将冻干后的鳗鲡脊骨粉碎备用。

1.4 鳗骨多肽工艺流程

根据杨会成等人[12]的方法有所改动。鳗鲡骨粉按一定料液比加入超纯水，调节pH 值至3.0，加入酸性蛋白酶，40 ℃水浴酶解；调节pH 值至7.0，加入中性蛋白酶和碱性蛋白酶的一定比例混合酶，45 ℃水浴酶解，灭酶（90 ℃，10 min）。4 ℃下以转速12 000 r/min离心10 min 得到鳗鲡脊骨多肽液。

1.5 鳗骨多肽的制备

固定料液比1∶15（g∶mL），pH 值3.0，酶解温度40 ℃，酶解时间3 h，酸性蛋白酶添加量分别为0，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，得到不同酸性蛋白酶添加量制备的鳗骨多肽溶液。固定料液比1∶15（g∶mL），混合蛋白酶混合比例（中性蛋白酶∶碱性蛋白酶（W∶W）） 1∶1，pH 值7.0，酶解温度45 ℃，酶解时间3 h，混合蛋白酶添加量分别为0，2%，4%，6%，8%，10%，得到不同混合蛋白酶添加量下制备的鳗骨多肽溶液。固定料液比1∶15（g∶mL），混合蛋白酶添加量6%，pH 值7.0，酶解温度45 ℃，酶解时间3 h，混合蛋白酶混合比例（中性蛋白酶∶碱性蛋白酶（W∶W）） 分别为1∶0，2∶1，1∶1，1∶2，0∶1，得到不同混合蛋白酶混合比例下制备的鳗骨多肽溶液。固定混合蛋白酶添加量6.0%，混合蛋白酶混合比例（中性蛋白酶∶碱性蛋白酶（W∶W）） 1∶1，pH 值7.0，酶解温度45 ℃，酶解时间3 h，料液比分别为1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，得到不同料液比下制备的鳗骨多肽溶液。固定料液比1∶10（g∶mL），第一步酶解中酸性蛋白酶添加量1.5%，pH 值3.0，酶解温度40 ℃，设置不同的酶解时间为0，1，2，3，4，5 h；第二步酶解中混合蛋白酶添加量6.0%，混合蛋白酶混合比例（中性蛋白酶∶碱性蛋白酶（W∶W）） 2∶1，pH 值7.0，酶解温度45 ℃，酶解时间分别为0，1，2，3，4，5 h，得到不同酶解时间下制备的鳗骨多肽溶液。

1.6 鳗骨多肽液中肽含量测定

根据李军[13]的方法有所改动，采用福林- 酚法测定酶解液中多肽的含量。

1.7 鳗骨肽钙的制备

根据张玲等人[14]的方法有所改动。测定鳗骨多肽液中多肽质量浓度后，根据测定后的多肽质量浓度以多肽∶钙（W∶W） =7∶1 添加CaCl2。将混合物于pH 值7.0，温度40 ℃条件下水浴孵化30 min。将无水乙醇（溶液体积的10 倍） 添加到混合溶液中，在 4 ℃下以转速12 000 r/min 离心10 min，收集沉淀物，冻干即为鳗骨肽钙。

1.8 鳗骨肽钙乳液制备及测定

根据Ren Z Y 等人[15]的方法有所改动。取鳗骨肽钙液，以不同比例的油与鳗骨肽钙液制备乳液，按照鳗骨肽钙液与油比例9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9 制备得到水包油型乳液，静置不同时间观察乳液状态（0 min，30 min，1 h，2 h，3 h，24 h） 并拍照记录，显微观察制备的新鲜乳液形貌并拍照记录。

1.9 数据分析

采用Origin 9.0 软件对试验数据进行分析，用LSD 方法进行显著性分析（p＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 不同制备条件对鳗骨多肽提取效果的影响

酸性蛋白酶添加量对制备鳗骨多肽的影响见图1。

图1 酸性蛋白酶添加量对制备鳗骨多肽的影响

由图1 可知，随着酶添加量的增加，所得原液多肽含量在一定范围内快速上升，随后下降。鳗骨中的蛋白质会在酶的作用下水解为多肽，过度水解会使多肽进一步水解为短肽和游离氨基酸，从而使多肽质量浓度减小[16]。当酸性蛋白酶添加量为1.5%时，原液多肽质量浓度达到最高，即此时鳗骨多肽得率最高。因此在试验中，为使产品含有较高的鳗骨多肽质量浓度，选取的酸性蛋白酶酶解鳗鱼骨粉制备鳗骨多肽最合适的酸性蛋白酶添加量为1.5%。

混合蛋白酶添加量对制备鳗骨多肽的影响见图2。

图2 混合蛋白酶添加量对制备鳗骨多肽的影响

由图2 可知，随着混合蛋白酶添加量的增加，鳗骨多肽得率快速上升后，上升趋势逐渐放缓后缓慢下降。当酶添加量达到一定值时，酶和底物的结合位点已经达到饱和，此时增加酶量不仅不能促使底物水解为多肽，反而将多肽水解成游离氨基酸，同时也会造成酶浪费。因此，为使产品含有较高的鳗骨多肽，选取的混合蛋白酶酶解鳗鱼骨粉制备鳗骨多肽最适的混合蛋白酶添加量为6%。

料液比对制备鳗骨多肽的影响见图3。

图3 料液比对制备鳗骨多肽的影响

由图3 可知，随着料液比的增加，鳗骨多肽得率呈下降的趋势，且下降趋势逐渐变缓。底物质量浓度随料液比的增大而减小，质量浓度越高，多肽得率越多，但是当料液比增加到一定程度时，一定量的酶水解底物的能力有限[17]。过多增大料液比不仅不能促使底物水解为多肽，会造成试验中物料的浪费。在试验中，为使产品含有较高的鳗骨多肽，选取的最适料液比为1∶10（g∶mL）。

蛋白酶混合比例对制备鳗骨多肽的影响见图4。

图4 蛋白酶混合比例对制备鳗骨多肽的影响

由图4 可知，随着混合蛋白酶中中性蛋白酶占比不断增加，鳗骨多肽得率呈上升趋势。试验中，为了得到更多的鳗骨多肽，选取的混合蛋白酶酶解鳗鱼骨粉制备鳗骨多肽，最适的中性蛋白酶∶碱性蛋白酶混合比例为2∶1（W∶W）。

酶解时间对制备鳗骨多肽的影响见图5。

图5 酶解时间对制备鳗骨多肽的影响

由图5 可知，随着酶解时间的不断延长，鳗骨多肽得率快速上升后，上升趋势逐渐放缓后下降。当酶解时间为6 h 时，多肽得率达到最高（p＜0.05），继续延长酶解时间，鳗骨多肽得率呈下降趋势。当酶解反应开始后，酶与底物迅速反应，使多肽得率增大，随着酶解时间的延长，酶水解底物的能力有限以及多肽会被过度水解成短肽和游离氨基酸，使得多肽得率下降[18]。因此，为使产品含有较高的鳗骨多肽含量，选取的最适酶解时间为6 h。

2.2 鳗骨肽钙包埋乳液制品稳定性分析

不同油水比下乳液的外观形貌（a） 和微观结构（b） 见图6。

图6 不同油水比下乳液的外观形貌（a） 和微观结构（b）

鳗骨肽钙乳液在不同油与肽液比例下的外观形貌显示（图6（a）），在油与肽液比例为4∶6 时乳液分层最快，在2 h 达到顶峰；在油与肽液的比例为9∶1 时，乳液分层相对较慢，在24 h 达到顶峰。另外，在油与肽液比例为9∶1，8∶2，7∶3，1∶9 时的乳液下清层比较浑浊，其他5 个乳液下清层相对澄清透明。多肽在油水界面上不同于传统乳化剂的单层排布，而是由于分子间相互作用在“油核”外层形成网状的“肽壳”结构[19]，多肽浓度增加使得壳层增厚及液滴间的聚集，从而导致粒径增大和分布变宽。多肽浓度低时形成的界面膜抗性差导致离心时发生破乳，难以维持乳液稳定，而高多肽浓度形成的液滴则可承受较大离心力[20]。不同油与肽液比例条件下的鳗骨肽钙乳液的微观结构显示（图6（b）），在油与肽液比例为1∶9，2∶8，8∶2 时，乳液呈现小液滴状态，液滴间的空间位阻阻止了液滴聚集变大。在油与肽液比例为6∶4 时，乳液液滴间发生了明显聚集，甚至破乳，出现了大油滴。其他条件下乳滴较少而且不明显。

3 结论

采用单因素试验探索出制备鳗骨肽液最优工艺，即第1 步酶解中酸性蛋白酶添加量为1.5%，pH 值为3.0，酶解温度为40 ℃，酶解时间为3 h；第2 步酶解中混合蛋白酶添加量为6.0%，混合蛋白酶混合比例（中性蛋白酶∶碱性蛋白酶（W∶W）） 为2∶1，pH 值为7.0，酶解温度为45 ℃，酶解时间为3 h。利用最优工艺参数制备鳗骨粉，其中肽液质量浓度为91.70 μg/mL。鳗骨肽钙可用于乳液制备，将来有望将其用于食品级功能性乳液的开发中。