液相色谱- 串联质谱法检测信阳水牛乳中唾液酸含量

张彩芳，徐 佳，张瑞廷，2

（1.漯河食品职业学院，河南漯河 462333；2.漯河市食品研究院有限公司，河南漯河 462300）

中国是世界第三大水牛养殖大国，信阳水牛作为中国水牛地方优良品种之一，主产于河南省信阳市，中心产区为信阳市的光山、罗山、新县等县区[1]。随着现代农业机械的发展，信阳水牛逐步从单纯的役用向乳用、肉用方向转化[2]。信阳水牛产乳性能较好，且乳脂率高达5%～10%，泌乳期一般7～8 个月，也有长达10 个月以上的，平均日产乳量3～5 kg。

水牛乳作为世界第二大乳源，具有良好的食用安全性[3]，其蛋白质、脂肪、维生素等含量远高于奶牛乳，免疫球蛋白G、溶菌酶等生物活性物质含量达到奶牛乳的5～10 倍[4]。同时，水牛乳中的维C、维E 等含量均高于奶牛乳。陈瑞芳[5]研究结果表明，水牛初乳中的免疫球蛋白G（lgG）、免疫球蛋白A（lgA）、类胰岛素生长因子（IGF-1） 含量分别是常乳的41.83，12.44，3.07 倍，说明水牛乳含有生物活性成分。Saksena R 等人[6]从水牛乳低聚糖中分离得到一种新型戊糖，具有免疫刺激活性，可提高免疫应答反应。罗曾玲等人[7]均对水牛乳中过敏原进行了相关研究，用益生菌水牛酸奶饲喂大鼠，发现益生菌水牛酸奶具有清除自由基的作用[8-9]。李玲等人[10]研究表明，水牛乳多肽具有抗氧化作用。Clare D A 等人[11]的研究显示，水牛乳中具有抗血栓肽作用的κ- 酪蛋白。潘健存[12]研究结果显示水牛初乳不仅能增强机体的免疫力，且有降糖降脂作用。水牛乳中的中链脂肪酸含量较饮用牛乳高，饮用水牛乳能使老年人的胆固醇水平降低，可预防老年性疾病[13-14]。Colarow L 等人[15]研究结果均表明，水牛乳具有抗炎、抗菌活性作用。以上研究结果均表明水牛乳具有一定的增强免疫力、抗氧化等功能特性，作为高级营养食品之一，水牛乳正逐渐成为人们消费的“新宠”[16-18]，前述研究均集中在水牛乳的营养和功能特性方面，少见对水牛乳中唾液酸的相关研究。

唾液酸（Sialic acid，SA） 是一种天然的碳水化合物，从唾液腺黏蛋白中提取分离得到[19]，故以唾液酸命名。唾液酸是高等动物和某些微生物具有的重要分子，在自然界分布很广，可作为重要物质基础实现糖复合物结构及功能多样化[20]，保护了生物大分子和细胞免受酶和免疫的攻击。2017 年，国家卫健委7 号文将N- 乙酰神经氨酸批准为新食品原料。目前，唾液酸生物学功能以及其应用于疾病预防与治疗方面的研究日益受到重视。动物试验结果显示，在仔猪膳食中添加唾液酸，可使大脑额叶皮质中唾液酸的含量增加，提高与学习相关的2 个基因的表达[21]。同时也有研究表明，SA 作为脑部营养素的一种，能促进婴幼儿大脑发育、增强学习能力、发育能力[22]。

测定SA 含量的方法种类众多，目前主要有分光光度法、色谱法（高效液相色谱法及气相色谱法）、酶联免疫法（ELISA）、核磁法及液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS） 等方法。基于SA 的化学性质，其容易与样品基质结合，导致前处理过程中纯化难度增加，由于SA 含量差异较大，要求检测方法的线性范围宽，抗干扰能力强。分光光度法存在敏感度不高、定量不够准确等问题。酶联免疫法成本较高且操作复杂。因液相色谱- 串联质谱法无需衍生即可对SA 定性定量测定且灵敏度高，采用超高效液相色谱- 串联质谱法定性定量测定水牛乳中的SA 含量，为进一步研究水牛乳中的SA 提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器

Agilent 6470 型液相色谱- 三重四极杆质谱仪；ML204T 型电子分析天平，梅特勒- 托利多仪器，上海有限公司产品；涡旋振荡器，广东晋元科技有限公司产品；超声波清洗器，昆山舒美超声仪器有限公司产品；Milli-Q 型超纯水仪，美国Millipore 公司产品；氮吹仪，美国Organomation 公司产品；旋转蒸发仪，德国Heidolph 公司产品。

1.2 样品与试剂

水牛乳，采自信阳水牛保种场；甲醇（色谱纯），乙酸铵（色谱纯），Fisher 公司提供；唾液酸标准品（纯度大于99%），Sigma 公司提供；HLB 固相萃取柱，Waters 公司提供；三氯乙酸（分析纯）、盐酸（优级纯），天津市科密欧化学试剂有限公司提供。

1.3 仪器条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Waters AtiantisTMT3（4.6 mm×150 mm，3 μm）；流动相：甲醇+0.1%乙酸铵溶液（4+6）；流速0.3 mL/min，进样量5 μL，柱温35 ℃。

1.3.2 质谱条件

电离模式：电喷雾负离子（ESI-） 模式；离子源温度150 ℃，毛细管电压2.8 kV，干燥气温度450 ℃，干燥气流量650 L/h，锥孔反吹气流量150 L/h，检测模式为多反应监测（Multi-reaction monitoring，MRM）模式。

唾液酸的多反应监测（MRM） 条件见表1。

表1 唾液酸的多反应监测（MRM） 条件

1.3.3 标准溶液的制备

精确称取唾液酸标准品，加入甲醇溶解，转移至10 mL 容量瓶中，甲醇定容，配制成唾液酸质量浓度为1 000 g/L 的标准品储备液，置于4 ℃冰箱冷藏备用。

标准品溶液系列：用流动相将1 000 g/L 标准品储备液分级稀释至10 μg/L，再分别稀释成质量浓度为0.01，0.02，0.05，0.10，0.50，1.00，2.00 μg/mL的标准溶液系列。

1.4 样品前处理

称取水牛乳样品（5.00±0.01） g 于50 mL 离心管中，加入质量分数为10%的三氯乙酸溶液20 mL，涡旋振荡混匀样品，超声10 min，加入质量分数为0.1%的盐酸溶液5 mL，超声5 min 后转移至50 mL容量瓶中，用超纯水多次清洗离心管，清洗液转移至容量瓶并用超纯水定容，于80 ℃水浴水解2 h，冰浴至室温，以转速12 000 r/min 离心15 min，取1 mL 上清液于真空旋转蒸发至近干，用流动相定容至1 mL 振荡超声，0.22 μm 有机滤膜过滤，待测。

2 结果与分析

2.1 质谱结果

分别尝试了正负离子模式，对唾液酸母离子进行全扫描后，发现正离子模式相比较与负离子模式，不仅母离子丰度偏低，产生的离子碎片更为复杂，且背景干扰更大，故最终选择负离子模式。按照仪器条件对水牛乳中唾液酸含量进行测定。

MRM模式下的提取离子流图见图1。

图1 MRM 模式下的提取离子流图

2.2 定量限和检测限试验结果

以信噪比S/N≥3 计算方法的检出限为0.3 μg/kg，以信噪比S/N≥10 计算方法的定量限为1.2 μg/kg。该方法灵敏度高，可满足水牛乳中唾液酸的检测要求。

2.2.1 回收率试验结果

在水牛乳基质中分别加唾液酸标准品浓度的50%，100%，150%，重复测量3 个不同浓度加标量3 次，结果表明回收率的RSD 值为2.48%，回收率为91.67%～98.15%，平均回收率为95.29%。

样品加标回收率见表2。

表2 样品加标回收率

2.2.2 重复性试验结果

重复性试验结果见表3。

表3 重复性试验结果

分别称取6 份水牛乳样品，经过前处理后进样分析。由表3 可知，6 份水牛乳样品中唾液酸含量的RSD 值为3.67%，证明该方法重复性良好。

2.3 线性回归试验结果

分别取质量浓度为0.01，0.02，0.05，0.10，0.50，1.00，2.00 μg/mL 的标准溶液，不同质量浓度标准品进样3 次。以3 次峰面积的平均值为纵坐标，标准品浓度为纵坐标绘制标准同线，计算标准曲线方程，结果表明唾液酸标准品在0.01～2.00 μg/mL 质量浓度范围内，与峰面积的线性关系良好，相关度为0.999 7。

线性回归试验结果见表4。

表4 线性回归试验结果

2.4 稳定性试验

取同一份水牛乳样品，经过前处理后，分别测定其在放置2，4，6，8，10 h 后的峰面积，RSD 值为2.30%，表示该样品溶液在10 h 内稳定。

稳定性试验结果见表5。

表5 稳定性试验结果

2.5 样品测定

分别选取5 种不同存栏期的水牛乳样品，经过前处理后测定其唾液酸含量。

不同存栏期水牛乳中唾液酸含量见表6。

表6 不同存栏期水牛乳中唾液酸含量

3 结论

唾液酸作为重要的元素参与婴幼儿大脑发育和认知发育。研究采用液相色谱- 串联质谱法对信阳水牛乳中唾液酸含量进行初步测定。结果表明，信阳水牛乳中唾液酸的含量为177～220 mg/kg。刘爽等人[23]2021 年对5 种市售牛乳样品中的唾液酸含量进行测定，结果表明5 种市售牛乳中唾液酸的含量为177.6～228.9 mg/L，该研究结果与之相接近。

该研究建立了液相色谱- 串联质谱法测定水牛乳中唾液酸的研究方法，样品预处理操作简单，无需衍生，分析范围较宽（0.01～2.00 μg/mL），相关系数达0.999 7，线性关系良好。采用该方法，信阳水牛乳样品的检出限为0.3 μg/kg，定量限为1.2 μg/kg，检测方法相对灵敏，精密度和准确性良好。信阳水牛乳中唾液酸回收率结果表明，不同浓度水平的样品加标回收率均在90%以上，加标回收含量的RSD为2.48%。该方法操作简单，降低了水牛乳中基质的干扰，可准确地测定信阳水牛乳中唾液酸的含量，为信阳水牛乳中唾液酸的测定提供有效可行手段，为信阳水牛的合理保护、乳及乳制品的开发利用探索更多可能性。