不同加工类型样品大肠菌群检测方法选择研究

郑二帅，曹 猛，李 娈，梁兰兰，廖熙娜

（广东美味鲜调味食品有限公司，广东中山 528400）

0 引言

大肠菌群作为食品安全控制环节中重要指标之一，GB 4789.3—2016 中提供了2 种方法，分别为第一法（MPN 法） 与第二法（平板计数法）[1]，不同的企业会根据自身的试验室设备、试剂、人员技能、样品种类及对检测结果交期的需求。自主选择第一法（MPN 法） 或第二法（平板计数法） 进行检测，对于2 种方法检测灵敏性，不同类型样品最适的检测方法，以确保结果的符合性研究的较少。规范不同类产品最适宜的检测方法，把好质量关，确保生产产品的食品安全性，是作为食品生产品控工作者的核心职责。

通过对不同类型样品同时用2 种检测方法进行检测，对比检测结果差异性，对差异性原因进行调查研究，为不同样品选择检测方法提供指导依据[2]。

大肠菌群测定第一法（MPN 法），采用以月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST） 为主要试剂的检测方法，通过在（36±1） ℃培养24～48 h，对产气发酵管，转接到煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB） 管中，（36±1） ℃培养条件下进行验证试验，确定样品中大肠菌群最大可能数MPN 值。

GB/T 4789.3—2016 大肠菌群测定第二法（平板计数法），采用结晶紫中性胆盐琼脂（VRBA） 主要试剂，以通过在（36±1） ℃培养24～48 h，挑取典型和可疑菌落至煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB） 管中，（36±1） ℃培养条件下培养24～48 h 进行复发酵验证试验。

1 材料试剂与试验方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

抽取两类典型样品，A：某公司经生产加工产品，细胞遭受破损的样品，分别为酱料半成品样200 份和腐乳半成品样220 份；B：某公司员工手部、工作服擦拭抽样，菌落细胞未经物理化学破坏的样品，共150 份。

1.1.2 试剂

月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）、煌绿乳糖胆盐（BGLB）、结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）、无菌磷酸盐缓冲液（KHPO）、无菌生理盐水、1 mol/L NaOH 溶液、1 mol/L HCl 溶液。

1.2 试验方法

依据标准：GB 4789.3—2016 的方法要求，分别采用第一法（MPN 法） 和第二法（平板计数法） 对样品进行检测，依据产品内控标准，对照检测结果对产品进行合格率判定。

1.3 样品合格率判定标准

样本的大肠菌群数合格判定标准依据企业标准制定，大肠菌群数＜3.6 MPN/g 或者＜3.6 CFU/g。

2 检测过程及结果

2.1 检测过程

样品检测均使用同一品牌同一批次的试剂，消除试剂的误差影响，检测人员为同一组2 名人员，均为检测经验3 年以上人员，以消除检测过程的人员操作误差。

2.2 检测结果

第一法（MPN 法） 和第二法（平板计数法） 的检测结果比较见表1，不同检测方法样品不合格率对比见图1。

图1 不同检测方法样品不合格率对比

表1 第一法（MPN 法） 和第二法（平板计数法） 的检测结果比较

2.2.1 结果分析

由表1 可知，采用GB 4789.3—2016 检测腐乳、酱料半成品样、员工手部、工作服擦拭样的不合格率经统计学分析（X2=0.076，p＞0.05） 差异无显著性，在总计570 份样品，第一法（MPN 法） 检测结果超出内控标准样品数为44 个，占比7.72%。第二法（平板计数法） 检测结果超出内控标准样品数为33 个，占比5.79%。第二法（平板计数法） 与第一法（MPN 法） 相比，绝对偏低1.93%，同比相对偏低25.0%。

不同类样品检测结果差异性较大，其中腐乳、酱料半成品样品，第一法（MPN 法） 的检测结果依据内控标准判定不合格率，分别为8.18%，5.50%；第二法（平板计数法） 检测结果依据内控标准判定不合格率分别为5.45%，3.50%。第二法（平板计数法） 与第一法（MPN 法） 相比，分别绝对偏低2.75%，2.00%，同比相对偏低33.6%，36.4%；2 种方法的检测结果偏差比较大，第二法（平板计数法） 检测量明显低于第一法（MPN 法） 的检出量。

员工手部、工作服抽样品，第一法的检测结果依据内控标准判定不合格率为10.0%，第二法（平板计数法） 的检测结果依据内控标准判定不合格率为9.3%，第二法（平板计数法） 与第一法（MPN 法）相比，绝对偏低0.7%，同比相对偏低7%；2 种方法的检测结果偏差不明显。

2.2.2 原因分析

（1） 样品的差异性- 细胞破损程度。腐乳、调味酱样品中存在的盐分、香辛料、防腐剂等抑菌物质会使微生物生长受到抑制，导致微生物代谢缓慢、代谢速率不一致。同时，调味酱样品中存在的油脂会包埋微生物，影响生长。该类产品经历了物理打磨、加热等生产加工破坏，部分细胞处于受损状态，活性不足。需要在修复受损细胞后方能进入对数生长期进行繁殖生长。

设备、容器工器具表面、手部表面取样，通过涂抹、擦拭或冲洗取得的样品中，含量微生物大多处于完好活跃状态，在适宜条件下能够快速进入对数生长期进行繁殖，在检测过程中显化出来。

（2） 检测方法差异性。第一法（MPN 法） 中，初发酵试剂月桂基硫酸盐胰蛋白豚肉汤（LST） 中含有磷酸氢二甲和磷酸二氢钾是较好的缓冲剂，能够较好维持LST 肉汤的PH 处于相对稳定状态，更适合大肠菌群生长[3]。第一法（MPN 法） 的初发酵时间是24～48 h，相对延长的初发酵时间，可使受损的细胞得到较为充分的恢复时间。因为加工食品大多经过磨碎、高温或冷冻等处理，大部分细菌的细胞处于受损状态，细胞修复恢复活性需要时间较长，延长到48 h，可以使细胞得到较为充分的恢复时间，进入对数生长期后积累一定的量，使检测结果显化出来，从而使初发酵管呈阳性，降低漏检几率。

第二法（平板计数法） 中，在结晶紫中性红胆盐琼脂的培养时间为18～24 h，此过程中，部分受损的细胞尚未修复完毕进入对数生长期[4]。没有充足的时间在平板上形成菌落形态，检测操作时覆盖的琼脂厚薄程度存在差异，也会造成菌落呈现的不一致性，存在一定数量的漏检菌落群，因此结果偏低[5]。

3 结论

3.1 第一法（MPN 法） 和第二法（平板计数法） 检测灵敏性

（1） 对于经过破坏性生产加工的样品，使用第一法（MPN 法） 检测的检出量要平均高于第二法（平板计数法） 的检出量。第一法（MPN 法） 的检测灵敏性更高一些。

（2） 对于一般性表面擦拭抽取样品，如设备、容器工器具表面、手部表面取样等，第一法（MPN法） 和第二法（平板计数法） 的检测量水平基本一致，无明显差异性。2 种方法检测灵敏性无明显差异性。

3.2 检测方法优劣对比性

在方法优劣性对比，第一法（MPN 法），优点：检测灵敏度高，准确性更强，检测操作过程相对比较简便，对人员操作技能要求相对较低；缺点：耗时长，需要72～96 h。第二法（平板计数法）[6]，优点：耗时短，需要48～72 h；缺点：相对第一法的灵敏度要略低，检测操作步骤多，操作比较繁琐，对平板典型菌落的判定和计数需要较高的认知能力，对检测人员技能要求高，检测成本高。

3.3 检测指导建议

在方法选择上，可以按照如下原则选择：

（1） 对于生产过程半成品及终产品等经历破坏性加工的样品，可优先选择第一法（MPN 法） 进行检测，以确保检测结果接近的真实水平的符合度。

（2） 对于一般性表面擦拭抽取样品，如设备、容器工器具表面、手部表面取样等，第一法（MPN法） 和第二法的检测量水平基本一致，无明显差异性。试验室可根据自身的试剂、仪器及交期要求自由选择检测方法。

（3） 对于部分样本目标菌含量较高，需要尽快了解样本目标菌群大致含量的，可采用第二法（平板计数法） 进行检测，通过平板上的典型菌落，做出大致性的初步结果报告，然后复发酵进一步长期验证试验。

建立在选取的2 种典型样本类型基础上做的分析结论，作为指导性的建议，并无绝对的要求，各实验室需要综合根据试验条件、检验交期、成本控制、人员技能等方面进行综合判断，选择检测方法。