液相色谱- 串联质谱法检测保健食品中6 种人参皂苷含量的方法研究

黄 南，项睿洁，苏 敏，陈晓雅，王 辉，杨天明，徐聪玲，孟 奇，陆梅阳

（浙江公正检验中心有限公司，浙江杭州 311500）

0 引言

日常检测中，保健食品中人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1 等6 种化合物的含量较高[1]，检测频率较高，目前人参皂苷的测定方法通常只针对某些特定的人参皂苷化合物，以高效液相色谱为主[2]，保健食品成分复杂，未净化对检测结果影响较大，分离时间过长[3]。拟采用高效液相色谱串联质谱技术，以期实现6 种人参皂苷主要成分的快速分离和准确定量。

1 方法简述

1.1 仪器与试剂

AB 3500 液相色谱串联三重四极杆质谱仪，配电喷雾（ESI） 离子源。

DV215CD 型电子分析天平，感量为0.000 01 g；CP1502 型电子天平，感量为0.01 g；涡旋混合器：IKA VORTEX GENI；DH5B 型台式离心机；HSCZY400 型氮吹仪；乙腈（CH3CN）：色谱级；甲醇（CH3OH）：色谱纯；甲酸（HCOOH）：色谱纯；乙酸铵（CH3COONH4）：分析纯；人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1 等6 种标准品，均购自坛墨质检科技股份有限公司（纯度≥99.0%）。

1.2 标准溶液配制

1.2.1 标准储备液

精密称取上述6 种标准品适量，甲醇溶解，配置成质量浓度1 000 μg/mL 的标准储备液，于-20 ℃条件下避光保存。12 个月内有效。

1.2.2 混合标准中间液

分别量取人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1 标准储备液各0.500 mL 于50.00 mL 容量瓶中，用甲醇稀释定容至刻度，配置成质量浓度10 μg/mL混合标准中间溶液。

1.2.3 混合工作液

吸取混合标准工作液适量用30%甲醇水配置成5.00～500 ng/mL 不同质量浓度的系列混合标准工作溶液，临用新配。

1.3 试验条件

1.3.1 提取

（1） 固态试样。称取胶囊内容物/研磨成粉的片剂0.5 g（精确至0.01 g），于50 mL 塑料离心管中，加入2/5 体积超纯水，涡旋30 s 混匀，超声提取20 min，以转速4 000 r/min 离心2 min，将上述上清液移取至50 mL 容量瓶中，残渣用15 mL 超纯水二次提取，合并提取液置容量瓶中，超纯水定容到刻度线，混至均匀，等待下一步操作（净化）。

（2） 液态试样。称取2 g（精确至0.01 g） 试样，于50 mL 塑料离心管中，加入3/5 体积超纯水，30 s涡旋混匀，置于超声仪中提取15～20 min，超纯水定容到刻度线，混至均匀，等待下一步操作（净化）。

1.3.2 净化

取活化好的固相萃取柱，准确移取2.0 mL 样品提取液上柱，20 mL 水分2 次淋洗去除水溶性杂质，待液体流干后，以70%的乙醇水溶液20 mL 进行洗脱，收集全部洗脱液，最终30%甲醇- 水定容至25.00 mL，混匀后过0.22 μm 混合滤膜，上机待测。如果样品中人参皂苷质量浓度超出线性范围，可稀释至线性范围内再次进样。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：Aglient C18柱（2.0 mm×100 mm，1.9 μm）；流速0.25 mL/min；温度40 ℃；进样量2 μL；流动相：A：0.1%甲酸-5 mmol/L 乙酸铵溶液B：CH3CN。

液相色谱梯度洗脱条件见表1。

表1 液相色谱梯度洗脱条件

1.3.4 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI-）。

负模式：电离模式ESI；检测方式为多反应离子监测（MRM）；气帘气压力（CUR） 为10.0 psi；碰撞气（CAD） 为medium；离子化电压（IS） 为-5 000.0 V；雾化温度（TEM） 为500.0 ℃；雾化气（GS1） 为50.0 psi；辅助气（GS2） 为50.0 psi；入口电压（EP） 为-10.0 V；出口电压（CXP） 为-10.0 V。

6 种化合物定性、定量离子和质谱分析参数参考值见表2。

表2 6 种化合物定性、定量离子和质谱分析参数参考值

2 结果与分析

2.1 提取和净化条件的优化

选择提取液的重要参考是人参皂苷的溶解性，一般提取人参皂苷的提取液有水饱和的正丁醇溶液、50%甲醇水、无水乙醇和超纯水等[4]。选取一个标示6 种人参皂苷均有的保健食品，在其余条件不变的情况下用上述4 种提取液分别进行提取，每种提取液进行3 组平行试验，取其平均值对比4 种经典提取液的提取效率。试验结果表明，4 种不同提取液对6 种人参皂苷的提取效率差距较小。考虑到经济实用及操作方便的情况，最终选择超纯水作为提取溶剂。

不同提取溶液提取率比较见图1。

图1 不同提取溶液提取率比较

保健食品天然成分较多，化合物种类相对复杂，选取合适的净化方式，可以有效地减少无关组分对目标化合物的干扰，延长色谱柱的使用寿命。因此，前处理的关键步骤之一为对提取液进行有效的净化与富集。SPE 提取净化方法中，常用的固相萃取柱有C18及HLB 固相萃取柱[5]。试验样品选取保健品中较为常见的胶囊（内容物为粉末） 作为研究对象，考查同一样品、单一变量（固相萃取方式） 的净化效果，以样品的回收率与基质效应（ME）作为指征，其中ME 以基质标准曲线各质量浓度点的响应值与混合标准工作液中相应浓度点的响应值计算，ME 值越接近100%，说明基质效应越低。比较C18、HLB、Alumina-N/XAD-2 3 种不同固相萃取柱的净化效果。

不同SPE 净化效果比较见图2，不同SPE 对回收率的影响见图3。

图2 不同SPE 净化效果比较

图3 不同SPE 对回收率的影响

由图2 可知，C18和HLB 柱净化后6 种目标物的基质效应远高于Alumina-N/XAD-2 型大孔吸附树脂复合固相萃取柱，这2 种固相萃取柱的回收率与Alumina-N/XAD-2 型大孔吸附树脂复合固相萃取柱相比并没有明显的优势（见图3）。故该试验采用的净化柱为Alumina-N/XAD-2 型大孔吸附树脂复合固相萃取柱。

2.2 色谱条件的优化

6 种人参皂苷的分子结构相类似，其中人参皂苷Rc 与Rb2 互为同分异构体，分子结构相同，存在的区别只在空间结构上，在色谱柱上的保留时间非常的接近，色谱分离时，各物质色谱峰分离度≥1.2 定量更加准确[6]。该研究采用Aglient C18柱（2.0 mm×100 mm，1.9 μm），流速0.25 mL/min，对梯度洗脱条件进行优化，使人参皂苷Rb2 和Rc 实现了完全分离，其余4 种目标物也较好地得到了分离。试验同时考查了同等条件下甲醇- 水和乙腈- 水体系流动相对6 种目标物质的分离效果。结果表明，甲醇-水体系流动相在洗脱能力方面不及乙腈- 水体系，且在乙腈- 水体系下目标物拥有更加对称的峰形。优化质谱参数的同时，发现乙腈- 水流动相中加入甲酸可以有效提高皂苷物质的响应信号，加入适量的乙酸铵，不仅增强了流动相的洗脱能力，同时目标物的峰形得到了有效改善。试验优化了甲酸、乙酸铵的添加量，最终确定浓度为5 mmol/L 的0.1%甲酸- 乙酸铵溶液- 乙睛流动相作为最终流动相，其他试验条件不变，该流动相下目标物洗脱的更完全，同时信号强度在一定程度上也得到了增强。

2.3 质谱参数的优化

质谱条件的优化用直接接二通方式进行，用0.25 mL/min 的流速将人参皂苷6 种化合物的标准溶液注入电喷雾离子源，根据总离子流响应值和分子离子峰响应值的强度确定最佳质谱参数，主要优化参数为DP 与CE，该试验首先对目标物进行Q1 扫描，得到母离子质量数，优化DP，保证母离子的传输效率；对母离子碰撞后，进行Q3 扫描，得到子离子质谱图[7]，优化碰撞能，然后在MRM 模式下使用优化好的DP 和CE 进行测试，再进一步优化毛细管电压，雾化器压力，干燥器温度和流速等质谱参数使离子化效率达到最佳。

6 种人参皂苷化合物多反应监测（MRM） 模式下色谱图见图4。

图4 6 种人参皂苷化合物多反应监测（MRM） 模式下色谱图

2.4 线性关系与定量限

将空白基质标准工作液由低到高浓度进样，在该试验所确定的仪器条件下对6 种人参皂苷进行测定，目标物浓度为横坐标，目标物峰面积为纵坐标绘制标准曲线得到线性方程。通过向阴性样品中添加目标物来考查方法的检出限。

6 种人参皂苷的线性方程与线性关系见表3。

表3 6 种人参皂苷的线性方程与线性关系

2.5 方法精密度和回收率验证

按上述试验方法操作，选择不含该试验所测的6 种人参皂苷的固体保健品分别进行3 个质量浓度6 次平行的加标回收试验，选择10，20，40 mg/kg 3 个质量浓度进行添加回收试验，方法平均回收率在81.4%～105.6%，表明该方法准确度较高。相对标准偏差为1.1%～7.8%，说明该方法精密度较好。

6 种人参皂苷的加标回收和重现性（n=6） 见表4。

2.6 稳定性试验

试验分别考查了6 种人参皂苷在提取后，在样品瓶中放置不同时间（2，6，12，24，48 h） 的稳定性。通过检测，6 种人参皂苷含量的RSD＜7.50%，说明该试验条件下样品稳定性良好，可以满足日常测定的要求。

2.7 市售样品的测定

对市售9 批保健食品采用1.2 的前处理方法进行分析比对，其中原材料标识含有人参、三七等五加科植物成分的有4 批，未标识含有的有5 批，分别按照该试验确定的最终条件进行处理与检测，结果表明，标识含有五加科植物配料的4 批保健食品均检出人参皂苷成分，6 种人参皂苷含量占0.40%～1.37%，与样品标签所标总皂苷含量基本一致；而剩余5 批未标识含有五加科植物成分的样品6 种人参皂苷均为未检出。

保健食品样品中6 种人生皂苷成分的测定结果见表5。

表5 保健食品样品中6 种人生皂苷成分的测定结果

3 结论

建立高效液相色谱- 液质联用法测定保健食品中6 种人参皂苷的检测方法。优化了前处理提取、净化、色谱和质谱条件，与其他干扰物有良好的分离。该方法简单、灵敏度高、专属性强，具有良好的线性和精密度和回收率。