烟叶香型特征致香成分研究及含量测定

张疏雨，云 晶，张善林，郝 捷，柴林山，李剑梅，谢存一，朱万芹，徐 冲

（1. 辽宁省微生物科学研究院，辽宁朝阳 122000；2. 内蒙古昆明卷烟有限责任公司，内蒙古呼和浩特 010000）

烟草是一种具有特殊香味的物质，人们通过吸食香烟，品尝其香味，可获得一定程度上的享受[1]。香型是指在烤烟烟叶燃吸过程中，产生的烟气所呈现的整体香气类型或风格[2]。而香韵是形成烟叶风格特色的基础，香韵的种类包括干草香、清甜香、焦甜香、正甜香、焦香、青香、辛香、木香、花香、果香、豆香、草药香、坚果香、树脂香、酒香等15种[3]。烟草所表现出的香气类型与烟草中含有的化学物质尤其是与烟叶香气相关的化学物质的种类和含量息息相关，研究表明，与烟叶香气有关的化学物质主要包括有机酸类、醇类、羧基类、酯类和内酯及杂环类化合物。这些烟叶致香物质的产生一般不是烟草碳、氮等基本代谢过程的直接产物，而是先合成脂类、萜类等不具挥发的大分子化合物，然后进一步在酶或非酶的作用下，分解转化形成的。这种不具挥发性的大分子化合物构成了致香物质成分的前体物质，构成烟叶香气的前体物质主要包括类胡萝卜素类、类西柏烷类、赖百当类、糖酯类、棕色反应类化合物等，一种香气的前体物质经特定的降解途径可形成特定的致香物质。通过大量文献查阅，以麦芽酚、乙基麦芽酚、香兰素、芳樟醇、β -大马酮为主要的考查指标，并采用高效液相色谱法（HPLC） 进行含量检测，以期提供科学的、简便的分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

1.1.1 材料

湖南永州（2019） 烟叶，内蒙古昆明卷烟有限责任公司提供。

1.1.2 试剂

麦芽酚（批号：J16O6R4435，纯度：98%）、乙基麦芽酚（批号：J16O6R4435，纯度：98%）、香兰素（批号：J24A6R2696，纯度：98%）、β - 大马酮标准品（HPLC≥98%）、芳樟醇标准品（HPLC≥98%），上海源叶生物科技有限公司提供；乙腈（色谱纯），赛默飞世尔科技（中国） 有限公司提供；乙酸铵（色谱纯），Xiya Chemical Technology（Shandong）Co.，Ltd 提供；甲酸（分析纯），北京化工厂提供；甲醇（色谱纯），星马克提供。

GL-21M型高速冷冻离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司产品；Waters2695 型高效液相色谱仪、Waters2489 型二极管阵列检测器，Waters 公司产品；色谱柱Luna C18（3） 仪器：100A（250 mm×4.6 mm，5 μm）、色谱柱Symmetry R C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），安捷伦产品；KQ-50DA 型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 烟叶特征致香成分研究

主要通过书籍及文献报道，总结归纳烟叶香型特征致香物质的种类，挖掘出对烟叶香韵贡献较大的代表性成分，最终确定以芽酚、乙基麦芽酚、香兰素、芳樟醇、β - 大马酮为考查对象，进行样品中的含量测定。

1.2.2 样品制备

准确称取烟叶样品5.000 g，用70%乙醇溶液对烟叶进行超声提取30 min，于4 ℃下以转速8 000 r/min 离心20 min，用针头过滤器过0.22 μm有机微孔滤膜，备用。

1.2.3 麦芽酚、乙基麦芽酚、香兰素含量测定

①标准储备液的配制，精密称取麦芽酚、乙基麦芽酚、香兰素各10 mg（精确至0.1 mg），分别置于10 mL 容量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得到相应标准储备液，质量浓度为1 mg/mL，于4 ℃下冰箱保存。②混合标准中间溶液的配制，精密量取麦芽酚、乙基麦芽酚、香兰素标准储备液各1.0 mL，置同一容量瓶（10 mL） 中，用水稀释至刻度，摇匀，得到混合标准中间溶液质量浓度为100 μg/mL，现用现配。③混合标准工作溶液的配制，分别精密量取中间标准溶液0.2，0.4，0.8，1.6，3.2 mL置于10 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，配制成质量浓度为2，4，8，16，32 μg/mL 的系列线性标准工作溶液，供高效液相色谱仪测定。④高效液相色谱条件，色谱柱：SymmetryR C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为以0.1%甲酸溶液∶甲醇= 85∶15（体积比），流速1.0 mL/min，紫外检测波长为273 nm，柱温为30 ℃，进样量10 μL。

1.2.4 芳樟醇高效液相法（HPLC） 含量分析方法研究

①芳樟醇标准溶液的配制，精密称取芳樟醇标准品20.00 mg，置于5 mL 棕色容量瓶中，加入无水乙醇使其溶解，并定容至刻度，摇匀，制得4 mg/mL的芳樟醇母液，4 ℃下避光存放备用。②高效液相色谱条件，色谱柱：色谱柱SymmetryR C18（3.9 mm×150 mm，5 μm），流动相：乙腈∶水= 1∶1（体积比）；流速1.0 mL/min，紫外检测波长为205 nm，柱温为30 ℃，进样量10 μL。③标准曲线制备，从4 mg/mL 芳樟醇标准品母液中，分别准确吸取0.2，0.6，1.0，1.4，1.8 mL 至5 mL 棕色容量瓶中，加无水乙醇定容至刻度，摇匀，制成梯度质量浓度分别为160，480，800，1 120，1 760 μg/mL 芳樟醇标准使用液，按照上述高效液相色谱条件上机分析，记录各浓度标准品溶液的吸收峰面积，以标准品溶液浓度为横坐标、相应的紫外吸收峰峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算曲线方程。同时，准确吸取供试样品液10 mL，加入一定含量的芳樟醇标准品，制备成加标样品液；分别取预先制备好的样品液、加标样品液上机分析，在规定的色谱条件下，定性考查样品液中芳樟醇的特征吸收峰保留时间及分离效果。

1.2.5 β - 大马酮高效液相法（HPLC） 含量分析方法研究

①β - 大马酮标准溶液配制，精密称取β - 大马酮标准品20.00 mg，用20 μL 移液枪转移至棕色容量瓶（5 mL） 中，用甲醇（色谱纯） 溶解并定容至刻度，即为4.00 mg/mL 的β - 大马酮标准储备液，4 ℃下避光保存，备用。②HPLC 色谱条件，色谱柱为SymmetryR C18（3.9 mm×150 mm，5 μm），流动相：甲醇（A） -30 mmol/L 乙酸铵水溶液（B），采用梯度洗脱程序进行检测（表1），流速0.9 mL/min，紫外检测波长227 nm，进样量10 μL，柱温30 ℃。③标准曲线制备，准确吸取0.125，0.250，0.500，1.000，2.000 mL β - 大马酮储备液于5 mL 棕色容量瓶中，用色谱纯甲醇定容至5 mL，即可得到质量浓度分别为100，200，400，800，1 600 μg/mL 的β - 大马酮标准使用液，按照上述高效液相色谱条件上机分析，记录各浓度标准品溶液吸收峰面积，以标准品溶液质量浓度为横坐标、相应的紫外吸收峰面积为纵坐标，绘制β - 大马酮标准曲线，并计算曲线方程。准确吸取供试样品液10 mL，加入一定含量的β - 大马酮标准品，制备成加标样品液，分别取预先制备好的样品液、加标样品液上机分析，在规定的色谱条件下，定性考查样品液中β - 大马酮的特征吸收峰保留时间及分离效果。

表1 β - 大马酮HPLC 梯度洗脱程序

β - 大马酮HPLC 梯度洗脱程序见表1。

1.2.6 方法学验证

①准确度，取已知含量的烟叶提取物样本6 份，分别加入标准品溶液，进行HPLC 分析，计算加标回收率。②精密度，取标准品溶液6 份，分6 次进行HPLC 分析，计算6 次结果的RSD 值。③稳定性，烟叶提取物样本分别于0，1，4，9，16，24 h 取样进行HPLC 分析，通过峰面积观察目标检测物的稳定性。④重现性，取已知含量的烟叶提取物样本6 份，进行HPLC 分析，通过峰面积验证目标检测物的重现性。⑤定量限及检出限，取标准品溶液，稀释1 000 倍，进行HPLC 分析，以仪器噪音的3 倍值作为仪器检出限，仪器噪音的10 倍值作为定量限。

2 结果与分析

2.1 麦芽酚、乙基麦芽酚、香兰素含量测定

2.1.1 标准曲线的建立

分别以麦芽酚、乙基麦芽酚、香兰素标准样品质量浓度（μg/mL） 为横坐标（X），相应样品峰面积分值为纵坐标（Y） 进行回归分析，绘制标准曲线。

麦芽酚标准品曲线见图1，乙基麦芽酚标准曲线见图2，香兰素标准曲线见图3，线性方程及相关系数见表2，混合标样HPLC 图谱见图4。

图1 麦芽酚标准品曲线

图2 乙基麦芽酚标准曲线

图3 香兰素标准曲线

图4 混合标样HPLC 图谱

表2 线性方程及相关系数

结果表明在规定的色谱条件下，标准烟片质量浓度为0～32 μg/mL 时，麦芽酚、乙基麦芽酚、香兰素浓度与紫外吸收峰峰面积呈良好的线性关系，其相关系数分别为R2=0.999 9，R2=0.997 7，R2=1。由图4可知，麦芽酚出峰时间为8～9 min，乙基麦芽粉出峰时间为25～26 min，香兰素出峰时间为30～31 min，且能达到基线分离。

2.1.2 方法学考查

①准确度分析，检测结果显示，同一烟叶样品6 次检测的RSD 分别为0.38%，0. 34%，0.35%，表明该方法回收率较好、准确度较高。②精密度分析，浓度为2 μg/mL 的标准品重复进样6 次，麦芽酚、乙基麦芽酚、香兰素的测定平均值分别为2.003，2.004，2.001 μg/mL，相对标准 偏 差RSD 分别 为0.26%，0.18%，0.29%（n=6），表明该方法精密度良好。③稳定性分析，在规定色谱条件下，分别在0，1，4，9，16，24 h 对样品溶液中麦芽酚、乙基麦芽酚、香兰素紫外吸收峰面积进行测定，其不同时间段的平均值分别为0.857 9，1.632，1.435 μg/g，相对标准偏差RSD 分别为1.11%，1.08%，1.91%（n=6），表明24 h 内试验稳定性良好。④重现性，检测结果显示，在规定的HPLC 色谱条件下，同批次烟叶样品重复进样6 次，供试样品液中麦芽酚、乙基麦芽酚、香兰素紫外吸收峰面积均值分别为108 053，259 338，252 608，相对标准偏差（RSD） 分别为0.35%，0.61%，0.80%（n=6），表明该方法有良好的重现性。⑤定量限及检出限，检测结果显示麦芽酚、乙基麦芽酚、香兰素的最低检出限分别为0.02，0.01，0.02 μg/mL；定量限为0.03，0.04，0.04 μg/mL，符合定量分析的要求。

准确度验证结果见表3，样品液HPLC图谱见图5。

图5 样品液HPLC 图谱

表3 准确度验证结果

2.2 芳樟醇与大马酮HPLC 含量测定

2.2.1 检测方法标准曲线建立

以标准溶液芳樟醇质量浓度（μg/mL） 为横坐标（X），HPLC 紫外吸收峰的峰面积为纵坐标（Y） 进行回归分析，绘制标准曲线。结果表明，在规定的色谱条件下，芳樟醇吸收峰的保留时间为9.7 min，下，样品溶液在9.7～9.9 min 内出现了芳樟醇特征吸收峰，且与样品中的其他组分均能达到良好的基线分离。

以β - 大马酮标准溶液质量浓度（μg/mL） 为横坐标（X），HPLC 紫外吸收峰峰面积为纵坐标（Y），进行回归分析，绘制标准曲线。结果表明，在规定的且质量浓度范围为160～1 760 μg/mL 时，芳樟醇质量浓度与紫外吸收峰峰面积呈良好的线性关系，回归方程为Y=13 480X+30 709，相关系数R2=0.996。

芳樟醇标准曲线见图6，芳樟醇HPLC图谱见图7。

图6 芳樟醇标准曲线

图7 芳樟醇HPLC 图谱

由图6、图7 可知，在相同的HPLC 色谱条件色谱条件下，β- 大马酮吸收峰的保留时间为11.8 min，在0.1～1.6 mg/mL 质量浓度范围内，大马酮浓度与紫外吸收峰峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：Y=29 865X+3×106，相关系数R2=0.996 5。

β - 大马酮标准曲线见图8，β - 大马酮HPLC图谱见图9。

图8 β - 大马酮标准曲线

图9 β - 大马酮HPLC 图谱

由图8、图9 可知，在相同的HPLC 色谱条件下，虽然样品液中成分复杂，但标准品及样品溶液在11.6 min 均出现了β - 大马酮特征吸收峰，且β -大马酮与样品中的其他组分的基线分离效果较好。

2.2.2 方法学考查

①准确度分析，检测结果显示，同一烟叶样品6 次检测的RSD 分别为1.19%，1.17%，表明方法回收率较好、准确度较高。②精密度分析，质量浓度为0.800 mg/mL 的标准品重复进样6 次，芳樟醇与大马酮的测定平均值分别为0.802，0.805 mg/mL，相对标准偏差RSD 分别为0.15%，0.65%（n=6），表明芳樟醇与大马酮测定方法精密度良好。③稳定性分析，在规定色谱条件下，分别在0，1，4，9，16，24 h 对样品溶液中芳樟醇、大马酮紫外吸收峰面积进行测定，其不同时间段的平均值分别为102.36，78.27 μg/g，相对标准偏差RSD 分别为0.24%，0.58%（n=6），表明24 h 内试验稳定性良好。④重现性，检测结果显示，在规定的HPLC 色谱条件下，同批次烟叶样品重复进样6 次，供试样品液中芳樟醇、大马酮紫外吸收峰面积均值分别为2 743 948，1 632 537，相对标准偏差（RSD） 分别为1.24%，1.66%（n=6），表明该方法有良好的重现性。⑤定量限及检出限，检测结果显示芳樟醇、大马酮的最低检出限分别为0.03，0.02 μg/mL，定量限为0.04，0.05 μg/mL，符合定量分析的要求。

准确度验证结果见表4。

表4 准确度验证结果

2.2.3 烟叶样品中芳樟醇及大马酮含量测定

按照试验建立的芳樟醇、β - 大马酮含量HPLC含量分析方法，对湖南永州的2019 年陈化烟叶中芳樟醇、β - 大马酮含量进行了测定分析。结果表明，在相同的色谱条件下，烟叶供试样品液分别在芳樟醇、β - 大马酮特征吸收峰保留时间形成了相同的特征吸收峰，所建立的HPLC 方法对样品中芳樟醇、β - 大马酮分离图谱稳定，方法可靠性高。

湖南永州（2019） 样品液β - 大马酮HPLC 图谱见图10，湖南永州（2019） 品液芳樟醇HPLC 图谱见图11。

图10 湖南永州（2019） 样品液β - 大马酮HPLC 图谱

图11 湖南永州（2019） 品液芳樟醇HPLC 图谱

3 结论

（1） 烟草所表现出的香气类型与烟草中含有的化学物质尤其是与烟叶香气相关的化学物质的种类和含量息息相关[3]，与烟叶香气有关的化学物质主要包括有机酸类、醇类、羧基类、酯类和内酯及杂环类化合物[4]。这些烟叶致香物质的产生一般不是烟草碳、氮等基本代谢过程的直接产物，而是先合成脂类、萜类等不具挥发性的大分子化合物，然后进一步在酶或非酶的作用下，分解转化形成[5]。这种不具挥发性的大分子化合物构成了致香物质成分的前体物质[6]，主要包括类胡萝卜素类、类西柏烷类、赖百当类、糖酯类、棕色反应类化合物等，一种香气的前体物质经特定的降解途径可形成特定的致香物质[7]。杜咏梅等人[8]从170 个烟样中分离测定出73 种致香成分，主要来源于六大类化合物，其中醛、酮类34 种，醇类8 种，内酯及酯类7 种，酚类6 种，呋喃类8 种，氮杂环类10 种。按照至香物质和前体物质之间的关系可将致香物质分为5 类：①异戊二间烯和降- 异戊二烯类，包括类胡萝卜素、无环类异戊间二烯、带环的类胡萝卜素降解化合物、双萜类、赖百当类、碳环的半倍萜烯和单萜烯；②脂类代谢产物，包括甘油酯类、糖酯类、磷脂类、神经鞘脂类等降解产物；③糖和氨基酸非酶棕化反应产物，包括氮杂环类的吡啶、吡咯、吡嗪类衍生物及呋喃、酸类和羧基化合物等；④生物碱及其转化产物，主要是氮杂环类的香气成分，如烟碱、假木贼碱等；⑤苯丙氨酸和木质素类代谢产物，主要有苯甲醇、苯甲醛、苯乙醛、苯乙醇、2 - 呋喃甲醛等[9]。

在我国的烟叶香型分类中，烟叶香型大致分为焦甜香和清甜香，焦甜香是浓香型香烟制品主要香韵特征，焦甜香型烟叶香气浓郁厚实，亦焦亦甜，浓焦厚甜是其主要特色，其成熟烟草的本质香气是烘烤香、甜香、清香、辛香、花香等多种香气混合的生成产物，是增强卷烟香味和扩展风格特色的重要组分，其主体贡献香韵多为有木香、焦香、焦甜香、辛香等。胡安福等人[10]对主流烟气焦甜、奶甜和豆香特征成分组群的分布特征和感官贡献分析，表明甲基环戊烯醇酮、麦芽酚、4 - 羟基- 2,5 -二甲基- 3（2H） - 呋喃酮等是构成焦香特征的主要致香物质，根据其化合物结构及产生途径分析，通常来至美拉德反应中经Amadori 产物降解生产的α - 二酮中间体；卢梦梦7]通过GC-MS 定性定量对宜宾市烤烟焦甜香香韵特征物质进行分析，其中主流烟气中与焦甜香香韵特色密切相关的致香物质有糠醇、苯酚、2 - 甲基苯酚、2 - 呋喃甲酸- 4 - 十五烷基酯、2 - 甲氧基苯酚、3 - 乙基苯酚、2,3 - 二氢苯并呋喃、5 - 羟甲基糠醛、烟碱、茄酮、金合欢醇、棕榈酸甲酯等；王鹏泽等人[11]以3 个香型的269 份烟叶样品为材料，采用偏相关分析、通径分析和逐步回归分析对烤烟香味成分（多酚、有机酸和中性致香成分） 与香韵（干草香、焦甜香、焦香、正甜香、清甜香和青香） 的关系进行研究，不同香型烤烟主要香味物质成分与香韵指标的关系的结果表明，氧化异佛尔酮、6 - 甲基- 5 - 庚烯- 2 - 醇、香叶基丙酮、苯甲醇、法尼基丙酮、β - 二氢大马酮、茄酮与焦甜香韵和焦香香韵呈极显著正相关且正面影响较大。周志磊[12]通过研究烟气甜味和苦味与主流烟气成分之间的相关性发现，杂环化合物和萜类化合物降解产物与烟气甜味有显著正相关，其中2 - 糠醛、甲基环戊烯醇酮、5 - 甲基- 2 - 糠醛、苯酚、3 -甲基- 2 - 环戊烯- 1 - 酮和麦芽酚等物质在影响烟气呈甜味方面贡献最大。朱远洋等人[13]研究焦糖化香料制备及在卷烟中应用，指出烟叶焦糖化反应产生甲基环戊烯醇酮、乙基环戊烯醇酮、糠醛、糠醇、呋喃酮、5 - 甲基糠醛、丁二酮等。李寿波等 人[14]基于美拉德反应产物的挥发性成分分析，显示挥发组分主要是酮类、醛类、醇类、酯类、吡啶、吡嗪、吡咯等，其中吡嗪和吡啶类物质是具有强烈焦糖香、烘烤香物质，与烟草协调性很好，能够修饰和掩盖部分杂气，改善余味，提升烟草香气。司晓喜等人[15]通过加热卷烟气溶胶中香气成分的分析，显示28 种卷烟气溶胶中比较，焦甜香突出的卷烟中乙基麦芽酚、香兰素、甲基环戊烯醇酮、3 - 羟基- 2 - 丁酮含量较高。冯云龙等人[16]利用水解多肽与葡萄糖在110 ℃下经美拉德反应形成香味物质，经检测主要致香物质为麦芽酚。可见，焦甜香香气风格的是多种致香物质协同作用的结果，其对焦甜香香韵均有贡献，其前体物质多为萜烯类、糖苷类、糖酯类及棕色反应类化合物降解产物，其中主要以棕色反应化合物形成焦甜香致香物质贡献最显著。综合文献报道，典型焦甜香的致香物质种类主要包括甲基环戊烯醇酮、乙基环戊烯酮醇、麦芽酚、乙基麦芽酚、4-羟基- 2,5 - 二甲基- 3（2H） - 呋喃酮、2,5 - 二甲基- 3（H） 呋喃酮、糠醛、糠醇、香兰素等。这些典型的焦甜香致香物质作为单体香料广泛应用于卷烟生产中的风味调制过程中。以麦芽酚、乙基麦芽酚、香兰素为指标开展相关检测，建立高效液相同步检测3 种物质的检测方法。

清香烟叶还有一种特征香型为清甜香，在烟叶复杂的化学成分中，具有清香特征的物质主要是中性香气成分，其与质体色素、西柏三烯类等降解物有关，其中类胡萝卜素和非环萜烯及其降解产物的种类接近100 种，有70%是类胡萝卜降解产物；李超等人[17]对全国主产区烟叶香型特质进行了排序：清香表现为云＞闽＞蜀，在对香型与香气的理化指标相关分析结果表明，与清香香型呈显著或极显著正相关的指标有苯乙醇、10 - 十一烯醛、兔耳草醛、异佛尔酮、巨豆三烯酮、β - 大马酮和异丁酸香叶酯；茅中一等人[18]采用全二维气相色谱- 飞行时间质谱联用仪对烟叶提取物致香成分进行了定性分析，明确了彰显清香特征的致香成分有11 种（见表5），其中7 - 甲基- 3,5 - 庚二烯- 2 - 酮、β - 大马酮和β - 二氢大马酮起重要作用；凌军等人[19]在设定的14 种重要致香成分中，云南清甜香典型片烟中有8 种挥发性致香成分含量显著高于3 组非典型碎烟，包括β - 大马酮、巨豆三烯酮的4 个同分异构体、二氢猕猴桃内酯、3 - 羟基- β - 二氢大马酮和3 - 氧代- α - 紫罗兰醇；其中，β - 二氢大马酮、β - 大马酮、巨豆三烯酮、二氢猕猴桃内酯、3 - 羟基-β - 二氢大马酮和3- 氧代- α - 紫罗兰醇属于具有代表性的类胡萝卜素类降解香气产物[20-21]；可见，在文献报道中，均体现了类胡萝卜素降解产物β - 二氢大马酮、β - 大马酮等成分在清甜香烟叶香韵增香方面有较为突出的贡献。芳樟醇是萜类化合物的重要组分之一，也是烟叶中主要的致香物质，刘巍等人[22]采用气相色谱- 质谱法在烟叶中检测到芳樟醇；另外，烟草品质的优劣很大程度上取决于烟叶中的致香物质，王玉华等人[23]发现中部烟叶中芳樟醇、α -松油醇、香叶醇、吡咯和喹啉等含量明显优于其他部位的烟叶，说明该类物质对卷烟制品中的风味形成产生一定的积极影响，这在一定程度上促进了中部烟叶感官品质的提升。研究表明，芳樟醇氧化物糖苷类属于烟叶潜香化合物，烟叶在微生物作用下，微生物代谢产生的胞外酶可有利于该类潜香物质转化成乙基香兰素等致香成分，使卷烟香气风格更加突出。另外在烟叶制品的加工生产中，β - 二氢大马酮、β - 大马酮、芳樟醇、7 - 甲基- 3,5 - 庚二烯-2 - 酮也是烟叶制品主要的单品香料，可提高清甜香烟叶制品烟气的圆润性和满足感，增加烟叶制品香气的丰富性[24]。综合多方面的研究结论，确定以β -大马酮、芳樟醇为主要的考查对象，并对其烟叶样品中的含量进行检测。

表5 清香特征的致香成分

清香特征的致香成分见表5。

（2） 建立麦芽酚、乙基麦芽酚、香兰素HPLC同步测定方法。在规定色谱条件下，麦芽酚吸收峰的保留时间为8～9 min；乙基麦芽酚吸收峰的保留时间为25～26 min；香兰素吸收峰的保留时间为30～31 min；3 种物质质量浓度为0～32 μg/mL 时，标准样品质量浓度与紫外吸收峰面积呈良好线性关系，其回归方程分别为麦芽酚Y=35 094X-16 954，相关系数R2=0.999 4；乙基麦芽酚Y=36 897X-33 531，相关系数R2=0.996 3；香兰素Y=33 786X-8 222.8，相关系数R2=0.999 9。样品液在20，26，30 min 左右出现特征吸收峰，通过加标试验验证相应麦芽酚、乙基麦芽酚、香兰素特征吸收峰，样品液及标准液均与其他各组分均达到良好的基线分离。建立的3 种物质同步检测色谱条件如下：色谱柱SymmetryR C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：0.1%甲酸溶液∶甲醇=85∶15（体积比）；流速1.0 mL/min，紫外检测波长为273 nm，柱温为30℃，进样量10 μL。

（3） 建立芳樟醇HPLC 含量测定方法。在规定的色谱条件下，芳樟醇吸收峰的保留时间为9.7 min，在160～1 760 μg/mL 范围内，芳樟醇质量浓度与紫外吸收峰峰面积呈良好的线性关系，回归方程为Y=13 490Y+18 143，相关系数R2=0.997 1；样品溶液在9.7～9.9 min 内出现了芳樟醇特征吸收峰，且芳樟醇峰与样品中的其他组分均能达到良好的基线分离。芳樟醇色谱条件：色谱柱：SymmetryR C18（3.9 mm×150 mm，5 μm）；流动相为以乙腈∶水= 1∶1（体积比）；流速1.0 mL/min，紫外检测波长为205 nm，柱温为30℃，进样量10 μL。

（4） 建立β - 大马酮含量测定方法，吸收峰的保留时间为11.8 min，且在100～1 600 μg/mL 质量浓度范围内，大马酮质量浓度与紫外吸收峰峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：Y=29 977X+140 680，相关系数R2=0.990 3，样品液在标准品及样品溶液在11.6 min 出现了β - 大马酮特征吸收峰，且基线分离效果较好。β - 大马酮的色谱条件：色谱柱为色谱柱SymmetryR C18（3.9 mm×150 mm，5 μm），流动相：甲醇（A） -30 mmol/L 乙酸铵水溶液（B） 梯度洗脱程；流速0.9 mL/min，紫外检测波长227 nm，进样量10 μL，柱温30 ℃。梯度洗脱程序：0～3 min 甲醇(A)-30 mmol/L 乙酸铵水溶液（B） 50∶50（V/V）；3～6 min，80∶20（V/V）；6～10 mim 80∶20（V/V）；10～13 min，50∶50（V/V）。

（5） 按照试验建立HPLC 分析方法，进行了烟叶样品中麦芽酚、乙基麦芽酚、香兰素、β - 大马酮、芳樟醇含量比对分析。试验对湖南永州2019 年陈化烟叶中5 种致香物质含量测定结果表明，所建立的HPLC 方法对样品中麦芽酚、乙基麦芽酚、香兰素、芳樟醇、β - 大马酮分离图谱稳定，但各组分检测结果显示5 种物质通过二氯甲烷萃取测得的含量均较低，因此在样品测定时可作为定性或半定量分析方法，在试验检测过程中可结合LC-MS 气质联用方法予以精确定量分析。