响应面法分析丹皮酚与常见酚类物质间的协同抗氧化作用

刘 建，赵贵红，王 波，王京雪，于伟东，张大虎，段升霞

（1. 菏泽学院农业与生物工程学院，山东菏泽 274000；2. 菏泽学院化工学院，山东菏泽 274000；3. 山东大树达孚特膳食品有限公司，山东菏泽 274000）

随着我国食品工业的快速壮大和不断发展，单一食品抗氧化剂的应用效果已经无法满足现代人对高品质生活的追求，所以复配协同抗氧化剂也逐渐成为当前食品生产过程中使用抗氧化剂的发展趋势，且其协同抗氧化的作用机理也已经逐渐引起国内外学者的高度重视[1-4]。如今，为找寻更加合理且高效的复合型协同抗氧化剂，人们将更多的精力放在研究这些天然的抗氧化剂间的相互作用上。复配型抗氧化剂是由2 种及以上的抗氧化剂进行不同比例、浓度的配比，用以提高食品抗氧化能力的抗氧化剂。不同的抗氧化剂经过复配可能会产生不一样的效果。如果抗氧化剂复配合理，就能使其中的组成成分起到协同作用，进而增强该食品的抗氧化能力。反之，则起不到协同效果。

丹皮酚，别称牡丹酚，是一种小分子酚类化合物，提取自牡丹的干燥根皮。据相关试验研究表明，丹皮酚具有抗菌、抗炎、抗氧化等多种对人体有益的药理作用[5-6]，且具有多种生物活性。张延龙等人[7]通过试验，发明了一种含牡丹酚的牡丹籽油复合天然抗氧化剂。将牡丹酚、茶多酚、抗坏血酸棕榈酸酯进行复配，所得的研究结果表明此3 种物质之间产生了明显的协同抗氧化作用。由此说明，该复合天然抗氧化剂具有显著的协同抗氧化能力，且对人体不存在毒性损害，具有优良的热稳定性等特性，可用于牡丹籽油的生产加工。

阿魏酸、槲皮素、儿茶素等多酚物质是从植物体内提取的一类酚类物质。这些多酚有着优良的抗氧化性，且清除自由基的能力较强[8-10]。它能与多种抗氧化物在生物体内相互配合发挥抗氧化作用，已经成为广受大众关注的天然抗氧化剂。石艳宾等人[11]为测定多酚物质的抗氧化活性，以DPPH 自由基清除率为评价标准，选取了茶多酚、儿茶素、绿原酸和没食子酸，并运用响应面试验方法，比较这些酚类物质的抗氧化能力。结果表明，这4 种酚类物质在清除DPPH 自由基方面均表现出较强的能力。且它们之间存在某种程度上的交互作用，但并不明显。

目前，丹皮酚与其他多酚类化合物抗氧化协同作用的研究较少，其协同作用效果及机制尚不清楚，但是将丹皮酚和常见多酚复配成抗氧化剂，具备较高的可行性，且在果蔬、肉等冷鲜食品的保鲜方面应用前景非常乐观[12]。前期研究发现，丹皮酚对于DPPH 自由基的清除效果并不明显，但表现出良好的清除ABTS 自由基活性。所以，研究以ABTS 自由基的清除活性评价丹皮酚、槲皮素、咖啡酸等的抗氧化活性，以期明确丹皮酚与常见酚类物质间的协同抗氧化作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

丹皮酚（纯度98%），上海源叶生物技术有限公司提供；槲皮素（纯度95%）、芥子酸（纯度98%）、抗坏血酸（纯度> 99%）、儿茶素（纯度≥95%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供；ABTS（纯度98%）、过硫酸钾（纯度99%）、咖啡酸（纯度99%）、对羟基苯甲酸（纯度≥99.5%）、阿魏酸（纯度99%）、3,4 -二羟基苯甲酸（纯度≥97%），上海麦克林生化科技有限公司提供；无水甲醇，烟台远东精细化工有限公司提供。

V-1200 型可见分光光度计，上海美析仪器有限公司产品；FA2004N 型电子天平，上海菁海仪器有限公司产品；冰箱，海尔智家股份有限公司产品；快速混匀器，江苏新康医疗机械有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 ABTS+·清除能力的测定[2]

ABTS 可与过氧化钾发生反应，ABTS 被氧化，生成蓝绿色的ABTS 阳离子自由基，该阳离子自由基较为稳定，在波长734 nm 处有最大吸收峰，在抗氧化剂的存在下，ABTS+·与抗氧化剂发生反应，使阳离子自由基褪色。

将0.192 g ABTS（纯度98%） 和0.033 g 过硫酸钾（纯度99%） 分别溶于50 mL 蒸馏水中，再等量混匀，室温黑暗条件下静置12~16 h 使其充分反应，12~16 h 后将其取出，即可得ABTS 母液，再向母液中加入适量蒸馏水进行稀释，使其在25 ℃，波长734 nm 处的吸光度为0.70±0.02，即得试验所需的ABTS+·工作液，工作液呈现透明绿色，需避光保存。取0.5 mL 不同浓度的丹皮酚、多酚物质或复配物溶液，分别将其加入已标记好的试管中，再分别向各个试管中加入ABTS+·工作液5 mL（其中空白管加入0.5 mL 蒸馏水，对照管则用0.5 mL 70%甲醇替代样品）。室温黑暗下静置600 s，于波长734 nm 处测定其吸光度。若样品具备清除ABTS 自由基的活性，则样品反应溶液吸光度会低于对照溶液。试验每份试样重复3 次。

1.2.2 丹皮酚与槲皮素等的协同作用效果

应用响应面分析法中的中心组合设计（CCD）四因素五水平试验考查丹皮酚与槲皮素等的协同作用效果，四因素分别为槲皮素、儿茶素、阿魏酸与丹皮酚；丹皮酚质量浓度分别为3，6，9，12，15 μg/mL；槲皮素质量浓度分别为1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 μg/mL；儿茶素质量浓度分别为1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 μg/mL；阿魏酸质量浓度分别为1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 μg/mL。所有试验均做3 次重复，并利用软件SPSS 19.0 对试验所得数据进行统计与分析，接着建立多元二次回归模型，分析该多酚物质间的协同抗氧化作用。

CCD 试验设计因素水平编码见表1。

表1 CCD 试验设计因素水平编码/μg·mL-1

1.2.3 复配溶液抗氧化协同系数（SE） 计算

通过计算多酚物质的复配溶液抗氧化协同系数（SE） 可得知，这些多酚物质之间是否具有协同抗氧化作用。通过试验可得复配溶液的清除率（ESC） 及理论清除率（TSC） 的比率，即SE 值。

当SE>1，表明该复配溶液有协同作用；SE<1，表明该复配溶液无明显的抗氧化协同作用。抗氧化协同系数SE 可由如下公式计算得知：

理论清除率（TSC） 的计算如下：

式中：ESC1，…，ESCn——各个溶液的试验清除率；

n——此评价体系中的所用抗氧化剂的数量。

2 结果与分析

2.1 多酚物质抗氧化能力比较

先配制不同质量浓度的丹皮酚、槲皮素、咖啡酸、儿茶素、芥子酸、抗坏血酸、阿魏酸、对羟基苯甲酸、3,4 - 二羟基苯甲酸试样，然后依据1.2.1中所示的试验方法，测定各个试样的吸光度。再根据吸光度值计算半数清除率IC50。

不同多酚物质对ABTS 自由基的清除率见图1 和不同多酚物质的IC50见表2。

图1 不同多酚物质对ABTS 自由基的清除率

表2 不同多酚物质的IC50

由图1 可知，随着多酚物质质量浓度的增加，ABTS 自由基清除率呈现上升趋势。其中，当阿魏酸的质量浓度上升至15 μg/mL 后，ABTS 自由基清除率变化渐渐趋于稳定；当槲皮素的样品质量浓度上升至30 μg/mL 后，ABTS 自由基清除率变化不明显且逐渐趋于稳定。该试验对多酚物质抗氧化性能的评价，以半数清除率IC50为指标，比较丹皮酚、槲皮素、咖啡酸、儿茶素、芥子酸、阿魏酸、抗坏血酸、对羟基苯甲酸、3,4 -二羟基苯甲酸的抗氧化能力的强弱。文中IC50值可以定义为清除ABTS 自由基50%时样品的质量浓度，所以IC50值越高，其抗氧化能力越弱，反之则越强。由表2 可知，槲皮素、咖啡酸、儿茶素、芥子酸、阿魏酸、3,4 -二羟基苯甲酸的IC50值小于对照物质维C 的IC50值，这些多酚物质的抗氧化性均较强。各种多酚物质的IC50值由低到高分别为槲皮素、阿魏酸、儿茶素、3,4 -二羟基苯甲酸、芥子酸、咖啡酸。选取IC50值由低到高排列的前3 位多酚化合物，即槲皮素、阿魏酸和儿茶素，并与丹皮酚进行复配试验。

2.2 多酚物质间抗氧化作用分析

2.2.1 响应面试验设计及结果

结合单因素试验结果，依据表1 进行响应面分析法中的中心组合设计（CCD），考查丹皮酚、槲皮素、阿魏酸、儿茶素间抗氧化能力的强弱。

CCD 试验结果及SE 值的计算结果见表3。

表3 CCD 试验结果及SE 值的计算结果

由表3 可知，CCD 试验的结果中，第29 组，即丹皮酚质量浓度为3 μg/mL，槲皮素质量浓度为2 μg/mL，儿茶素质量浓度为2.5 μg/mL，阿魏酸质量浓度为2 μg/mL，复配协同系数SE 大于1。说明在合适的浓度下，4 种多酚物质有协同抗氧化作用。

2.2.2 方差分析

将表3 中所得的试验数据利用软件Design Expert 8.06 进行回归分析。

回归模型方差与分析见表4。

表4 回归模型方差与分析

由表4 可知，丹皮酚（A）、儿茶素（C） 的p 值均大于0.005，说明这2 种多酚对清除率的影响不大；但槲皮素（B）、阿魏酸（D） 的p 值接近0.000 1，表明这2 种多酚物质对ABTS 自由基清除率的影响较明显。各多酚物质间存在某些程度上的交互作用，但均不明显。多酚物质间的交互作用由小到大的顺序依次是B 与D、C 与D、A 与C、B 与C、A 与D、A与B。

2.2.3 回归模型的建立及抗氧化性分析

根据CCD 试验所得结果进行回归分析，并创建全变量二次回归模型：

ABTS 自由基清除率（%）= 44.35-0.67A+3.30B+1.97C+3.25D-1.19AB-0.37AC-0.61AD-0.46BC-0.04BD-0.36CD+1.25A2-0.63B2-0.17C2-0.30D2.

由表4 可知，模型中p<0.01 时，表明差异非常明显；且失拟项p=0.063 1>0.05，表示失拟项不明显，表明这是适宜丹皮酚、槲皮素、阿魏酸、儿茶素的协同抗氧化能力的数学分析模型。回归方程的系数表现其显著性。由此可得，对ABTS 自由基的清除率的影响较明显的是B，C，D，且影响因素由强到弱依为B，D，C。由于B，C，D 的一次项系数为正数，说明它们在清除ABTS 自由基方面存在正相关性。

2.2.4 响应面交互作用分析

利用软件Design Expert 8.06 对表3 所得的数据进行分析。A 和B 对ABTS 自由基清除率的影响见图2，A和C 对ABTS 自由基清除率的影响见图3，A 和D 对ABTS 自由基清除率的影响见图4。

图2 A 和B 对ABTS 自由基清除率的影响

图3 A和C 对ABTS 自由基清除率的影响

图4 A和D 对ABTS 自由基清除率的影响

由图2 ~图4 可知，随多酚物质质量浓度的提高，ABTS 自由基清除率呈现明显的上升趋势，即其对清除ABTS 自由基的能力逐渐增强。图2 ~图4 为多酚物质两两之间的交互作用响应曲面图，可直观地观察到多酚物质的响应值变化。这几组响应曲面图表现出，该4 种多酚物质在清除ABTS 自由基方面都有影响。同时，由于各个响应曲面图的坡度不同，表明这4 种多酚物质对ABTS 自由基清除率的影响强度不同。在该响应面试验的设计中，复配组合第29组，即丹皮酚质量浓度为3 μg/mL，槲皮素质量浓度为 2 μg/mL，儿茶素质量浓度为2.5 μg/mL，阿魏酸质量浓度为2 μg/mL，SE 值大于1。4 种多酚物质在合适的质量浓度下，能达到明显的协同作用，进而加强了丹皮酚的ABTS 自由基的清除能力。

3 结论

槲皮素、咖啡酸、儿茶素、芥子酸、阿魏酸、3,4 -二羟基苯甲酸对清除ABTS 自由基的能力高于对照物质维C。丹皮酚与槲皮素、丹皮酚与儿茶素、丹皮酚与阿魏酸、槲皮素与儿茶素、槲皮素与阿魏酸、儿茶素与阿魏酸对ABTS 自由基清除率存在负相关作用。第29 组，即丹皮酚质量浓度为3 μg/mL，槲皮素质量浓度为2 μg/mL，儿茶素质量浓度为2.5 μg/mL，阿魏酸质量浓度为2 μg/mL，SE 值大于1，4 种多酚在合适的质量浓度下，能达到明显的协同作用，进而加强丹皮酚的ABTS 自由基清除能力。研究需要在后续的工作中优化丹皮酚、槲皮素质量浓度、儿茶素质量浓度和阿魏酸的复配质量浓度，明确其协同作用机制。