美味牛肝菌蛋白质的超声波辅助提取工艺及功能性质研究

郭 磊，张绍英，刘家奇，何加鲜，阚 欢，刘 云

（西南林业大学轻工与食品工程学院，云南昆明 650224）

美味牛肝菌（Boletus edulis Bull.Fr.）是世界著名的野生菌，在欧洲被称为“王者牛肝菌”[1]，是一种在世界范围内分布的食药兼用、经济价值较高的真菌，我国各省区均有分布，尤其西南地区产量较高[2]，且全世界已知的牛肝菌属已有1 024种，我国已知的可食用的就有199种[3]。云南美味牛肝菌含有丰富的蛋白质、粗纤维、多种氨基酸，以及丰富的磷、钾、钙、镁、铁和锌等人体必需矿物质元素[4]，多种生物碱可治腰腿疼痛、手足麻木、盘骨不舒、四肢抽搐、妇女白带异常等症[5]，具有很高的食用价值和药用价值。

传统的蛋白质提取方法有碱溶酸沉法、酶法、非蛋白质法、复合法等[6-8]，而碱溶酸沉法具有简单易行、成本低、提取率高、纯度较高等优点。超声波技术能够使细胞中的可溶性成分与溶剂分子更好地接触，从而使可溶性成分更好地释放出来[9-10]，是近些年发展的一种高效物理提取技术，在食品加工业中应用广泛[11-14]。

目前，美味牛肝菌的研究主要集中加工和活性成分的提取等方面，对美味牛肝菌蛋白质的提取及功能性质研究方面未见报道。试验采用超声波辅助碱法提取云南美味牛肝菌蛋白质，初步探讨其功能特性，以期为增加美味牛肝菌的附加值、蛋白质工业生产和开发利用提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

云南美味牛肝菌，云南易门县康源菌业有限公司提供；标准牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-250，上海励瑞生物技术有限公司提供；氢氧化钠、无水乙醇、磷酸、盐酸、氯化钠，以上均为分析纯；食用油，市售。

FA1004型电子天平，上海精密科学仪器有限公司产品；DHG-9240A型鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司产品；JSP-200型多功能粉碎机，浙江永康金穗机械制造厂产品；L550型台式低速离心机，湖南湘仪试验室仪器开发有限公司产品；723C型可见分光光度计，上海欣茂仪器有限公司；BC/BD-213H型卧式转换型冷冻箱，河南新飞电器有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 牛血清蛋白标曲的绘制

参照赵玉红等人[15]采用考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量，绘制牛血清蛋白的标准曲线。

1.2.2 蛋白质得率

美味牛肝菌经干燥、粉碎过筛后提取蛋白质，离心分离得上清液，采用考马斯亮蓝法测定上清液中蛋白质含量，蛋白质得率计算公式如下：

1.2.3 美味牛肝菌蛋白质的提取工艺及优化

以蛋白质得率为指标，研究料液比、提取温度、超声波功率、氢氧化钠溶液质量浓度、提取时间等因素对美味牛肝菌蛋白质提取效果的影响。蛋白质提取的因素设置为以下水平：固定提取温度65℃，超声波功率300W，氢氧化钠溶液质量浓度7 g/L，提取时间1.5 h，考查不同的料液比1∶40，1∶50，1∶60，1∶70，1∶80对蛋白质得率的影响；固定料液比1∶60，超声波功率300 W，氢氧化钠溶液质量浓度7 g/L，提取时间1.5 h，考查不同提取温度45，55，65，75，85℃对蛋白质得率的影响；固定料液比1∶60，提取温度65℃，氢氧化钠溶液质量浓度7 g/L，提取时间 1.5 h，考查不同超声波功率250，300，350，400，450 W对蛋白质得率的影响；固定料液比1∶60，提取温度65℃，超声波功率400 W，提取时间1.5 h，考查不同氢氧化钠溶液质量浓度5，6，7，8，9 mg/mL对蛋白质得率的影响；固定料液比1∶60，提取温度65℃，超声波功率400 W，氢氧化钠溶液质量浓度7 g/L，考查不同提取时间0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h对蛋白质得率的影响。

在单因素的基础上，选择对美味牛肝菌蛋白质得率影响较大的料液比、提取温度、超声波功率、提取时间为考查因素，采用四因素三水平正交试验进行优化获得云南美味牛肝菌蛋白质的最佳提取工艺条件。

因素与水平设计见表1。

表1 因素与水平设计

1.2.4 美味牛肝菌蛋白质的功能性质

（1）美味牛肝菌蛋白质的制备。利用蛋白质在pH值=pI时发生蛋白质析出的方法得到蛋白质沉淀。按照最佳条件将蛋白质提取液的pH值准确调至4.5并静置2 h后，再经高速离心机以转速4 000 r/min离心30 min，干燥后用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量为65.7%。

（2）溶解性。①温度对蛋白质溶解性的影响。参考张燕鹏等人[16]的方法并略作调整，将1%的蛋白质溶液分别在30，40，50，60，70，80，90℃下水浴加热1 h后快速冷却至室温，以转速4 000 r/min离心30 min，取上清液用紫外可见分光光度计于波长595 nm处测定吸光度。②pH值对蛋白质溶解性的影响。参考张燕鹏等人[16]的方法并略作调整，用1 mol/L的HCl和NaOH溶液调节1%的蛋白质溶液，使其pH值分别为2，3，4，5，6，7，8，9，于室温下搅拌1 h后以转速4 000 r/min离心30 min，取其上清液于波长595 nm处测定吸光度。③离子强度对蛋白质溶解性的影响。参考张燕鹏等人[16]方法并略作调整，将1%蛋白质溶液各1 mL置于质量分数分别为1%，2%，3%，4%，5%的NaCl溶液中，然后调节pH值梯度依次为2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，于室温下搅拌1 h后以转速4 000 r/min离心30 min，取其上清液于波长595 nm处测定吸光度，同时以不加蛋白质的溶液为空白。

（3）持水性。参照Lqari H等人[17]方法并略作调整，称取1 g美味牛肝菌蛋白质置于离心管中与去离子水混合均匀，静置10 min后以转速4 000 r/min离心20 min，除上层液体后称质量，按公式（2）计算持水性（WHO），以大豆分离蛋白为对照。

式中：W1——分离蛋白质质量，g；

W2——离心管质量，g；

W3——离心管和持水后样品质量，g。（4）起泡性及泡沫稳定性。参照Lawhon J等人[18]方法并略作调整，取1%蛋白质溶液50 mL以转速8 000 r/min搅拌1 min后测定泡沫体积V0。静置120 min后测量泡沫的体积V120，经公式（3）、（4）计算起泡能力（FC）和泡沫稳定性（FS），以大豆分离蛋白为对照。

（5）持油性。参照Fuhrmeister H等人方法并略作调整，取1 g蛋白质与10 mL大豆油放入离心管中并振荡混匀后，以转速4 000 r/min离心20 min除去游离的油脂，再次称质量，按公式（5）计算持油性（FBC），以大豆分离蛋白为对照。

式中：W1——离心管和蛋白质质量，g；

W2——蛋白质、油脂和离心管质量，g；

W0——蛋白质质量，g。

2 结果与分析

2.1 牛血清蛋白标曲的绘制

于波长595 nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、牛血清蛋白标准液质量浓度为横坐标，得出标准曲线及回归方程Y=0.752 9X+0.005 9，R2=0.997 4，线性范围在0~0.1 mg/mL。

牛血清蛋白标准曲线见图1。

图1 牛血清蛋白标准曲线

2.2 单因素试验

2.2.1 料液比对蛋白质得率的影响

料液比对蛋白质得率的影响见图2。

由图2可知，美味牛肝菌蛋白质的得率随着料液比的升高呈现先增大后减小的变化趋势。在料液比为1∶60（g∶mL）时，得率达到最大，为15.390%。这是由于随着料液比的增大，体系的黏度降低，传质过程加快，因而得率提高，综合考虑最适料液比为 1∶60。

图2 料液比对蛋白质得率的影响

2.2.2 提取温度对蛋白质得率的影响

提取温度对蛋白质得率的影响见图3。

图3 提取温度对蛋白质得率的影响

由图3可知，美味牛肝菌蛋白质得率随提取温度的升高呈先增后减的趋势，并在提取温度为65℃时达到最大，为15.326%。这是因为前期温度的升高有利于蛋白质的溶解，同时超声波的作用加速了蛋白质的溶出；但提取温度过高，提取出来的蛋白质变性析出会导致上清液中蛋白质含量降低，得率减小。因此，最适提取温度均为65℃。

2.2.3 超声波功率对蛋白质得率的影响

超声波功率对蛋白质得率的影响见图4。

图4 超声波功率对蛋白质得率的影响

由图4可知，美味牛肝菌蛋白质得率随超声波功率的增大呈先增后减的趋势，并在超声波功率为400 W时达到最大，为16.028%。这是由于超声波功率的增大，超声波对细胞的破碎作用也越强，云南美味牛肝菌中蛋白质溶出也越多而使得率不断增大；但超声波功率过大时部分蛋白质发生变性，导致得率降低。因此，最适超声波功率为400 W。

2.2.4 氢氧化钠溶液质量浓度对蛋白质得率的影响

图5 氢氧化钠质量浓度对蛋白质得率的影响

氢氧化钠质量浓度对蛋白质得率的影响见图5。由图5可知，美味牛肝菌蛋白质的得率随着氢氧化钠溶液质量浓度的升高呈现先增大后减小的变化趋势，并在氢氧化钠溶液质量浓度7 g/L时达到最大，为16.515%。这是因为蛋白在碱性条件下溶解度较大，所以碱液浓度越高蛋白质得率越高；但当碱液浓度过高，蛋白质二、三级结构解体而引起变性，导致蛋白质得率降低，因此最适氢氧化钠溶液质量浓度为7 g/L。

2.2.5 提取时间对蛋白质得率的影响

提取时间对蛋白质得率的影响见图6。

图6 提取时间对蛋白质得率的影响

由图6可知，美味牛肝菌蛋白质得率随提取时间的延长呈先增后减的趋势，提取时间2 h时得率最高，为16.956%。提取时间过长，蛋白质会凝聚沉淀，导致蛋白质得率降低。因此，最适提取时间为2 h。

2.3 正交试验

基于单因素的试验结果，建立L9（34）正交试验。

正交试验结果见表2。

表2 正交试验结果

由表2可知，影响美味牛肝菌蛋白质得率的因素由大到小依次为B（提取温度）>A（料液比）>C（氢氧化钠溶液质量浓度）>D（提取时间），超声波辅助碱法提取美味牛肝菌蛋白质的最佳条件为A2B3C3D2，即料液比1∶60（g∶mL），提取温度75℃，超声波功率450 W，氢氧化钠溶液质量浓度7 g/L，提取时间2 h，在此工艺条件下进行验证，蛋白质得率为17.001%。

2.4 美味牛肝菌蛋白质的溶解性

2.4.1 提取温度对蛋白质溶解性的影响

提取温度对蛋白质溶解度的影响见图7。

图7 提取温度对蛋白质溶解度的影响

由图7可知，当提取温度为70℃时美味牛肝菌蛋白质的溶解度最小；提取温度在30~60℃时升温有助于蛋白质的溶解；在60~70℃时，随着提取温度的升高，美味牛肝菌蛋白质发生变性，导致溶解度降低；当温度超70℃时，可能因为部分蛋白质分子的聚集体转化为可溶性聚集体，而造成蛋白质溶解度增大，这说明高温处理可以改善美味牛肝菌蛋白质的溶解性。

2.4.2 pH值对蛋白质溶解性的影响

pH值对蛋白质溶解性的影响见图8。

图8 pH值对蛋白质溶解性的影响

由图8可知，当pH值4.0时接近等电点，故美味牛肝菌蛋白质的溶解度较小，当pH值不断增大，美味牛肝菌的溶解度也随之增大。pH值对蛋白质的解离性和带电性影响很大，改变了蛋白质同水的结合能力，从而影响其溶解性。

2.4.3 离子强度对蛋白质溶解性的影响

氢化钠溶液质量分数对蛋白质溶解性的影响见图9。

图9 氢化钠溶液质量分数对蛋白质溶解性的影响

由图9可知，pH值为2和4时美味牛肝菌蛋白质的溶解性变化随氯化钠溶液质量分数增加表现不明显，溶解性差于其他pH值条件；在pH值6时的溶解性随氯化钠溶液质量分数的增加略有提升，可能由于蛋白质表面的电荷增加利于蛋白质溶解，而后继续增大氯化钠溶液质量分数时发生盐析而导致溶解度下降；在pH值为8和10时的碱性条件下蛋白质带较多静电荷，但盐溶液的正负离子屏蔽了静电荷，同时氯化钠与蛋白质争夺水分子的能力增强，使蛋白质溶解性降低。

2.5 美味牛肝菌蛋白质的功能性质分析

美味牛肝菌蛋白质的功能性质分析见表3。

表3 美味牛肝菌蛋白质的功能性质分析 /%

由表3可知，美味牛肝菌蛋白质与香椿籽蛋白质、菜籽蛋白质、大豆分离蛋白质和美藤果蛋白质相比，在起泡性方面具有较显著的优势，持水性和泡沫稳定性略高于香椿籽蛋白质，但持水性和持油性明显低于其他几种蛋白质。功能性质方面的差异主要与蛋白质的分子结构、浓度、分子间相互作用等因素有关，美味牛肝菌蛋白质分子能快速地扩散到气-液界面并通过分子间作用形成黏弹性的吸附膜。

3 结论

影响美味牛肝菌蛋白质的超声提取因素主要有料液比、提取时间、氢氧化钠溶液质量浓度和提取温度，在单因素试验结果的基础上采用正交试验优化得出美味牛肝菌蛋白质的最佳超声波提取条件，即料液比1∶60（g∶mL），提取温度75℃，超声波功率450 W，氢氧化钠溶液质量浓度7 g/L，提取时间2 h，此条件下蛋白质得率为17.001%。

提取温度、pH值和离子浓度对美味牛肝菌蛋白质溶解性的影响不同，较高提取温度和pH值、较低离子浓度对美味牛肝菌蛋白质的溶解特性是有利的。美味牛肝菌蛋白质在起泡性方面优于香椿籽蛋白质、菜籽蛋白质、大豆分离蛋白质和美藤果蛋白质，持水性和泡沫稳定性略高于香椿籽蛋白质，但持水性和持油性明显低于其他几种蛋白质。