湖南酱类中主要微生物的研究及黄曲霉毒素B1的监测

贺 燕，唐小兰，何 娟，王亮亮，肖 稳，王晓庆

（湖南省食品质量监督检验研究院，湖南长沙 410007）

蚕豆酱，也称为豆瓣酱，是湖南岳阳地区家庭制作和食品企业生产的主要酱类产品，以去皮蚕豆为主要原料，经蒸煮、自然接种或人工纯种接种，发酵后拌以食盐等其他调味料，经调配之后形成的色香味俱全的调味品。永丰辣酱是湖南双峰特产，以小麦为主要原料，通过自然接种制作曲醅，经发酵、晒干、磨碎，再配以辣椒、食盐、水等经晒制而成。该产品气味芳香、味道极鲜，含有丰富的蛋白质及各种微量元素，并且具有促进新陈代谢之功效[1]。蚕豆酱和永丰辣酱都属于湖南人民餐桌上的上好调味品，但美中不足的是产品易发生黄曲霉毒素B1超标、胖听等质量安全问题。其原因为国内发酵豆制品的生产模式以小作坊为主，发酵过程在开放的环境下进行。另外，因原料在收货和贮存过程中受外界环境的影响，产生黄曲霉毒素和污染其他微生物，导致胖听和变质现象[2]。试验拟以传统蚕豆酱和永丰辣酱的曲胚、发酵半成品、成品等为对象，研究这2类特色酱类中的主要微生物，旨在从微生物的角度来寻求一条防控黄曲霉毒素B1超标的途径，为企业提供技术指导。

1 材料与方法

1.1 样品、培养基与试剂

1.1.1 样品来源

蚕豆酱，岳阳市川康酱品有限公司、湖南省十三村食品有限公司、岳阳临湘华一食品公司提供。

永丰辣酱，湖南湘军永丰辣酱有限公司、湖南曾府辣酱有限公司、双峰丰新农业公司提供。

选取6个公司的原料、曲种，发酵半成品、发酵成品等25个样品。

1.1.2 培养基、染色液及试剂

察氏培养基、PDA培养基、孟加拉红培养基、PCA培养基、结晶紫中性红胆盐琼脂培养基（VRBA培养基）、棉兰乳酚染色液、革兰氏染色液；甲醇（色谱纯），上海安谱有限公司提供；甲酸（AR），上海国药有限公司提供。

1.1.3 霉菌种

标准米曲霉菌种CICC2358、标准总状毛霉菌种CICC40531，中国菌种保存中心提供。

1.2 仪器与设备

MIR-254型生化培养箱、VITEK2型细菌鉴定仪、80i型尼康显微镜、AB/SCIEX QTRAP 4500型液相色谱-三重四极杆串联质谱仪。

1.3 试验方法

1.3.1 蚕豆酱和永丰辣酱的优势微生物分析

（1）采样中优势微生物的分离、纯化、计数。优势微生物的研究拟采用稀释平板分离计数法[3]。霉菌和酵母分离采用PDA和察氏培养基、孟加拉红培养基，大肠菌群采用结晶紫中性红胆盐琼脂培养基，细菌采用营养琼脂培养基。试验中样品因有原料、曲胚、发酵半成品和成品，考虑到每种样品含有的微生物不同，实际操作中宜进行较高稀释度的稀释，特别是曲胚。

霉菌的分离和纯化采用玻片插入培养方法。

（2）微生物的分类鉴定。根据霉菌培养的菌落特点及镜检孢子的微观结构，并结合《真菌鉴定手册》[4]，对酱类产品中的霉菌进行分类鉴定。细菌经纯化之后采用VITEKⅡ型细菌鉴定仪进行鉴定。

1.3.2 黄曲霉毒素B1测定

按照GB 5009.22—2016食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定。

2 结果与分析

2.1 微生物体系的组成分析

分别对蚕豆酱和永丰辣酱的酱胚、半成品和成品进行分离计数后，按培养基和菌落特征进行归类，初步确定了两大类酱类微生物体系的组成，以利于产品质量控制的研究。

对蚕豆酱、永丰辣酱的酱胚、半成品和成品进行了不同培养基的分离培养后。

蚕豆酱不同发酵阶段微生物的组成见表1，永丰辣酱不同发酵阶段微生物的组成见表2。

表1 蚕豆酱不同发酵阶段微生物的组成

表2 永丰辣酱不同发酵阶段微生物的组成

结果发现，蚕豆酱发酵过程中主要微生物体系组成为霉菌、细菌和酵母。由于采用了不同厂家的样品，但主要微生物体系组成的结论一致，3种微生物的构成比例在不同的发酵阶段不同，出现了消长的现象。不同厂家的酱类产品微生物不同发酵阶段组成大同小异，源于相似的制曲工艺、发酵工艺、原料，因厂家生产环境、人员操作的差异而导致了个体在数量上的微小变化。酱类产品在不同阶段出现霉菌、细菌、酵母消长的现象。第一阶段是霉菌迅速繁殖阶段。经人工纯种接种或自然接种的前期制曲胚阶段，接种的主要微生物是霉菌，并且培养的环境一般为28~30℃，此阶段霉菌占绝对优势，并分泌各种的酶，如糖化酶、蛋白酶等，为后期的入池发酵准备条件。第二阶段是细菌和酵母迅速繁殖阶段。在这个阶段，工艺中一般添加了食盐进行发酵，较高浓度的食盐和氧气的缺乏，霉菌的生长受到抑制，细菌和酵母有所增长[5]。第三阶段是微生物生长受抑制阶段。由于代谢产物的积累，微生物生长基本停止。从生产工艺来看，根据传统的蚕豆酱和永丰辣酱制作工艺，有高温晒制工艺，永丰辣酱的小麦曲有洗曲过程，这也是影响微生物体系组成的因素，特别是霉菌，在成品普遍检出率不高。

2.2 微生物的鉴定

2.2.1 优势霉菌的鉴定[4，6]

分别选择了PDA、马铃薯蔗糖培养基、孟加拉红培养基、察氏培养基，发现霉菌在PDA、孟加拉红培养基、察氏培养基上生长较为好，从霉菌生长的速度和菌落特征来看PDA和察氏培养基相当，孟加拉红可能因加入了抗生素，菌落个头和数量较PDA和察氏培养基要小，这和有关培养基对酵母和霉菌检测结果影响研究的结论一致[7]。

（1）永丰辣酱中优势霉菌菌落生长形态及显微形态特征。

永丰辣酱在PDA和孟加拉红培养基上分离得到的霉菌见图1，经纯化后的A菌落特征见图2，菌落A显微特征图谱见图3，经纯化后的B菌落特征见图4，B菌落显微镜特征图谱见图5，标准米曲霉菌落形态及显微特征图谱见图6。

图1 永丰辣酱在PDA和孟加拉红培养基上分离得到的霉菌

图2 经纯化后的A菌落特征

图3 菌落A显微特征图谱

图4 经纯化后的B菌落特征

图5 B菌落显微镜特征图谱

图6 标准米曲霉菌落形态及显微特征图谱

永丰辣酱经孟加拉红和PDA培养基进行分离后主要得到2种优势霉菌（如图1，图2），经纯化分离后得到2种菌，即A，B，其特征分别描述为：①A菌落呈纯白色厚绒状的大菌落，生长迅速，3 d后可布满整个培养皿孢子呈黑色（图2），肉眼可以看到菌丝上面分布着黑色孢子，发展成熟后，整个菌落呈深褐色，顶部基本上为黑色。其显微镜特征（图3）：菌丝呈无色透明状，无横隔，孢子囊呈球形，分生孢子自顶囊全面着生，像菊花状，表面略显粗糙。参照齐组同编写的《中国真菌志》第5卷曲霉属及其相关有性型可步鉴定属于曲霉属中的黑曲霉。②B菌落2 d后长成直径为1.5~2.0 cm的白色菌落，3 d后菌落中间出现黄色小点，4 d后外圈有白色菌丝，中层为黄色，内圈凸起且因有孢子原因呈现为黄绿色孢子，随着进一步的培养，孢子布满整个菌丝上面，出现黄绿或蓝绿色的菌落，如图4菌落形态。在显微镜下观察，分生孢子梗较长，菌丝无色透明，顶囊粗大，近似椭圆形，小梗着生于顶囊上半部，分生孢子呈串着生在小梗的顶端（如图5），根据标准米曲霉菌落形态及显微特征（如图6），同时参照齐组同编写的《中国真菌志》第5卷曲霉属及其相关有性型可步鉴定属于曲霉属中的米曲霉[8]。

永丰辣酱主要采用传统的自然发酵，从分离和鉴定得到的霉菌菌系来看，主要是以黑曲霉和米曲霉为主。另因生产是开放的环境下进行，对生产过程中微生物的污染不能有效控制，在抽检的企业中存在个别其他霉，如青霉、黄曲霉菌，因而安全性会存在一定的问题。黑曲霉具有产纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等酶系功能[9]。米曲霉是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。永丰辣酱的原料主要为小麦、糯米等，这就需要产淀粉酶、蛋白酶、糖化酶能力强的霉菌来分解原料。辣酱前期制曲阶段的霉菌菌相的组成，特别是有益曲霉属的存在，成为直接决定辣酱产品发酵成功的关键。

（2）蚕豆酱中优势霉菌的菌落生长形态及显微形态特征。

蚕豆酱中不同培养时间的霉菌菌落特征见图7，蚕豆酱主要霉菌显微特征见图8。

图7 蚕豆酱中不同培养时间的霉菌菌落特征

图8 蚕豆酱主要霉菌显微特征

从湖南省岳阳地区抽取的3家企业10多个样品中，经多种真菌培养基上分离主要得到一种霉菌：在PDA上首先生长为纯白色，随后菌落中间出现黄色小点，接着黄色孢子增多并逐渐转变为黄绿色孢子，随着进一步的培养，孢子布满整个菌丝上面，出现黄绿色菌落，如图7菌落形态。在显微镜下观察，分生孢子梗较长，菌丝无色透明，顶囊粗大，近似椭圆形，小梗着生于顶囊上半部，分生孢子呈串着生在小梗的顶端（如图8），根据标准米曲霉菌落形态及显微特征（如图6），同时参照齐组同编写的《中国真菌志》第5卷曲霉属及其相关有性型可步鉴定属于曲霉属中的米曲霉[8]。

蚕豆酱分自然发酵的方法和纯种接种发酵，自然发酵是指制曲的过程是在开放式条件下进行。有研究表明，霉菌是在发酵过程中起主要作用的一类微生物，从酱曲中分离所得到的霉菌有黑曲霉、米曲霉、酱油曲霉、高大曲霉等[10]。为便于稳定产品质量，目前有很多厂家使用发酵剂纯种进行发酵。试验从抽取的3家企业从原料、发酵半成品、发酵成品分离的结果来看，分离得到的优势霉菌菌种为米曲霉，但也有个别企业的产品出现了其他霉菌，经鉴定为黄曲霉菌。

2.2.2 引起永丰辣酱胀包现象的优势细菌的鉴定

永丰辣酱主要采用的是传统自然发酵，在开放的环境下，易受到外界环境中微生物的污染，易产生胀包、变色等现象。针对企业提出的成品酱易出现胀包现象，试验对部分成品酱按照GB 4789的方法进行了大肠菌群、细菌、霉菌和酵母的检测，结果发现大肠菌群和霉菌酵母均未检出，菌落总数达到了108数量级。从菌落形态来看，存在着几种优势菌，对优势菌进行分离纯化，经革兰氏染色后上VITEK2进行生化鉴定，确定引起辣酱胀包现象的主要优势细菌为耶尔氏菌、甲基杆菌属、鲁沃夫不动杆菌。

2.2.3 永丰辣酱中黄曲霉毒素B1含量

从3家不同的企业中抽取原料、半成品、成品进行黄曲霉毒素B1的检测。

永丰辣酱原料、半成品、成品中黄曲霉毒素B1的含量见表3。

表3 永丰辣酱原料、半成品、成品中黄曲霉毒素B1的含量

永丰辣酱通常采用传统的自然发酵，工艺路线基本相同，但是3个不同的企业却出现截然不同的结果，特别是湖南C辣酱有限公司，抽取的3个酱都已超过国标的限量要求5.0 μg/kg[11]，最高者达到了13.97 μg/kg。黄曲霉毒素是真菌毒素的一种，主要由黄曲霉和寄生曲霉2种真菌菌株产生，此外还有曲霉、青霉、根霉等。黄曲霉毒素是强致癌物质,是毒性极强的剧毒物质[12]，毒性是氰化钾的10倍，砒霜的68倍[13]。因而安全问题需引起高度重视。追溯到对湖南C辣酱有限公司成品酱的微生物特别是霉菌分析发现，此3个样品除了有优势霉菌——米曲霉和黑曲霉之外，因为露天发酵，还存在着其他的杂霉——经鉴定为黄曲霉菌。黄曲霉菌广泛存在于土壤、灰尘、植物及其果实上，辣酱在发酵过程中，要注意加工场所的环境条件，控制好发酵工作间的温度和湿度，防止滋生其他杂菌，从来引起质量安全问题。

2.2.4 蚕豆酱中黄曲霉毒素B1的含量

从3家不同的企业中抽取原料、半成品、成品，进行黄曲霉毒素B1的检测。蚕豆酱主要采用的纯种酱曲发酵，所以上文对蚕豆酱的霉菌分析主要为米曲霉且菌种比较单一。但个别厂家因生产环境差，特别是曲房多年未进行清理，导致发酵过程中其他霉菌的滋生，从而影响产品的品质。

蚕豆酱原料、半成品、成品中黄曲霉毒素B1含量见表4。

表4 蚕豆酱原料、半成品、成品中黄曲霉毒素B1含量

从表4中的结果来看，3家企业中岳阳市E酱品有限公司的发酵中间品黄曲霉毒素B1出现严重超标现象，高者达到30.03 μg/kg。分析其原因，产品中霉菌种类除了优势菌米曲霉之外，还有黄曲霉菌，其中黄曲霉菌是产生黄曲霉毒素B1的一个来源。对于该企业，致使滋生黄曲霉菌的主要原因是曲房和生产环境条件恶劣，其次原料品质、发酵工艺条件也能影响到黄曲霉毒素产生，已有研究[14]发现，发酵温度为30℃和32℃时黄曲霉毒素值最小。

3 结论

（1）通过对6个酱类生产企业从原料、曲胚、酱胚、半成品、成品的微生物分析，得出酱类产品不同发酵阶段霉菌、酵母、细菌出现消长的现象，这与发酵过程中不同阶段的主要任务和代谢产物有关。

（2）根据霉菌菌落形态及显微特征并结合有关霉菌鉴定书籍，对永丰辣酱和蚕豆酱中的主要霉菌进行了鉴定，确定了永丰辣酱中主要的优势霉菌为米曲霉和黑曲霉，蚕豆酱中主要的优势菌为米曲霉。通过分析酱产品中主要优势霉菌，为企业控制好产品质量提供了菌种知识的理论指导。

（3）利用VITEK2对易引起辣酱产品胀包现象的细菌进行鉴定，并确定引起辣酱胀包现象的主要优势细菌为耶尔氏菌、甲基杆菌属、鲁沃夫不动杆菌。下一步应对此3类菌进行生理生化研究，并对其进行防腐条件的探索，有望解决酱制品中易出现胀包的质量问题。

（4）从酱类企业的原料、半成品和成品的黄曲霉毒素B1的监测结果发现，黄曲霉毒素B1严重超标的问题主要是发酵过程中滋生了黄曲霉菌。酱料生产企业应注意曲房等环境条件，在制曲和发酵过程中控制好温度和湿度，促进优势霉菌的生长，防止其他杂菌的滋生，同时严把原料关，以防止黄曲霉毒素的污染。此外，国内外在进行黄曲霉毒素的防控方面有物理、化学、生物技术进行脱毒处理研究[15]。下一步，若能将这些研究将应用到酱类产品中黄曲霉毒素B1的脱毒处理上，将会极大地推动酱类产品的发展。