HPLC-MS/MS 法同时测定口服液保健食品中非法添加的降压和壮阳抗疲劳类药物

曾 羲，戚 平，汪 宁，林子豪，钱振杰，周庆琼，蔡伟谊，彭名军

（广州市食品检验所，广东 广州 511400）

0 引言

保健食品是指具有特定保健功能或以补充维生素、矿物质为目的的食品[1]。近年来，传统观念认为，保健食品比药品更安全、更健康且无副作用，口服液类保健食品也因其食用方便、吸收率高等优势备受消费者青睐，使得保健品行业呈现出飞速发展的态势[2]。目前，我国批准的保健食品功能有27 种[3]，其中降压类和壮阳抗疲劳类保健食品对消费者的吸引力较大，且添加的可能性也较大[4-5]。一些商家为牟取暴利，在保健食品中添加目的性药物，以达到见效快的目的，从而增加了保健食品的安全隐患[6-9]。

近年来，保健食品中非法添加药物常用的方法有气相色谱-串联质谱法[10]、超高效液相色谱法[6，11]、（超） 高效液相色谱－串联质谱法[9，12-13]、QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法、超高液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱法等。其中，气质法需要衍生化处理，较繁琐费时；液相法对基质复杂的样品定性时易出现假阳性；液相质谱法的扫描方式选择性强、灵敏度高、定量及定性能力强，可以检测出多组分超低含量的化合物。

基于近年来保健食品中易检出的项目，选择了22 种降压类和壮阳抗疲劳类非法添加药物，综合检测成本、提取效率和同分异构体分离鉴定等因素，建立了高效液相色谱-串联质谱同时检测口服液保健食品中非法添加的22 种降压类和壮阳抗疲劳药物的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

口服液保健食品，购于当地市场；实验室用22 种药物标准物质（纯度均大于98%），北京振翔科技有限公司提供；乙腈和甲醇（色谱纯），美国Thermo Fisher Scientific 公司提供；实验室用水为超纯水；其他化学试剂均为分析纯，广州化学试剂厂提供。

1.2 仪器与设备

API4000 型高效液相色谱-串联质谱联用仪，美国ABSCIEX 公司产品；2600TH 型超声清洗器，上海安谱科学仪器有限公司产品；SECURA224-1CN 型电子天平，美国Sartorious 公司产品。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

（1） 标准溶液的配制。准确称取上述标准品适量，用甲醇振荡溶解，配成质量浓度为1.0 mg/mL 的单个标准储备液，于-20 ℃下避光密封贮存。分别精密量取标准储备液适量用甲醇定容，使用前用样品基质提取液稀释成6 个标准浓度的工作液。工作液的标曲范围为1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0 ng/mL。

（2） 样品溶液的配制。准确称取1.000 0 g 样品于50 mL 容量瓶中，加入约40 mL 甲醇- 水溶液（50∶50，V/V），超声提取10 min，取出冷却至室温后，再定容至50 mL，过0.22 μm 聚四氟乙烯滤膜后待测。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：Thermo Accucore aQ C18（50 mm×2.1 mm，2.6 μm）；流动相A：乙腈；流动相B：0.1%甲酸（V/V） -10 mmol/L 乙酸铵水溶液。梯度洗脱程序：0～1.5 min，90% B；1.6～3.0 min，90%～65% B；3.1～8.0 min，65%～10% B；8.1～9.0 min，10% B；9.1～10.0 min，90% B。柱温40 ℃，进样量10 μL，流速0.3 mL/min。

1.3.3 质谱条件

电喷雾离子（ESI+） 源，喷雾电压5.5 kV，离子源温度550 ℃，雾化气压0.38 MPa，辅助加热气压0.38 MPa，气帘气0.17 MPa。多反应监测（MRM）质谱。

22 种非法添加违禁药物的质谱参数及保留时间见表1。

表1 22 种非法添加违禁药物的质谱参数及保留时间

2 结果与分析

2.1 色谱条件优化

由于目标化合物的数量较多，故选用较长的Thermo Accucore aQ C18（50 mm×2.1 mm，2.6 μm）柱进行分离。分别考查了以0.1% 甲酸（V/V）-10 mmol/L 乙酸铵水溶液-乙腈、10 mmol/L 乙酸铵水溶液-乙腈、0.1% 甲酸（V/V） -10 mmol/L 乙酸铵水溶液-甲醇和10 mmol/L 乙酸铵水溶液-甲醇等4 种体系作为流动相，观察各流动相的分离效果。结果表明，0.1% 甲酸（V/V） -10 mmol/L 乙酸铵水溶液-乙腈作为流动相时，各目标化合物的响应均较优，且检测灵敏度和离子化效率最高。

目标化合物阿替洛尔的极性较大，保留时间较短，故0～3 min 采用较高比例的水相延缓出峰时间，3～8 min 不断提高有机相的比例能较好地分离出其他21 种化合物，且同分异构体（羟基豪莫西地那非和代艾地那非、豪莫西地那非和伐地那非、伪伐地那非和那莫西地那非） 均能够较好地分离。故综合以上因素得到1.3.2 中的色谱条件。

22 种化合物的总离子色谱图见图1。

2.2 质谱条件优化

分别将22 种非法添加物的标准储备液（1 mg/mL） 用甲醇稀释成100 ng/mL 的对照液，在正离子模式下，直接推针进样，优化质谱条件。发现22 种目标化合物在正离子模式下均有较好响应。确定母离子后，用子离子扫描方式选择相对离子丰度高的2 个作为二级碎片离子。在这22 种药物中，有3 组同分异构体，分别为羟基豪莫西地那非和硫代艾地那非、豪莫西地那非和伐地那非、伪伐地那非和那莫西地那非，对二级碎片离子进行比对分析，通过不同的出峰时间，结合选择不同子离子分析鉴别，最终得到1.3.3 中的质谱条件。

图1 22 种化合物的总离子色谱图

2.3 样品前处理条件优化

参考胡青等人的研究结论，用纯甲醇为提取溶剂，并优化提取条件，采用甲醇-水（50∶50，V/V）作为提取溶剂。

2 种提取溶剂的提取回收率比较见图2。

图2 2 种提取溶剂的提取回收率比较

由图2 可知，甲醇为提取溶剂时，有3 种化合物的提取回收率低于80%，且利血平的提取回收率仅有50%，其可能原因是利血平极易溶于水不溶于甲醇。当采用甲醇-水（50∶50，V/V） 作为提取溶剂时，各目标化合物的提取回收率均在80%～120%，利血平的提取回收率显著增加。因此，以甲醇-水（50∶50，V/V） 为提取溶剂。

比较了不同超声时间（5，10，15 min） 对目标化合物的提取效率影响，结果见图3。从不同超声时间的提取回收率看，超声时间在10，15 min 时，22 种目标化合物的提取效率均介于80%～120%，当超声时间为5 min 时，有6 种目标化合物的提取回收率在80%以下。故在进行方法学验证和实际样品检测时，选用超声时间为10 min。

超声时间的提取回收率比较见图3。

图3 超声时间的提取回收率比较

2.4 方法学验证

2.4.1 方法的线性范围、检出限和定量限的测定

按1.3.1 中标准曲线的配制方法，在1.3.2 和1.3.3 仪器条件下，依次进样10 μL 进行分析，在1.0～50.0 ng/mL 线性范围内，以目标化合物的峰面积为纵坐标（y），以质量浓度（x，ng/mL） 为横坐标，通过Multiquant 软件进行标准曲线的绘制，根据3 倍信噪比（S/N=3） 和10 倍信噪比（S/N=10） 分别计算检出限（LOD） 和定量限（LQD），各种目标化合物在线性范围内的相关系数（r） 均大于0.99。

2.4.2 加标回收率试验及精密度

对经检测不含非法添加化学药物的空白样品（红牛维生素功能饮料） 进行加标回收率的试验和精密度试验。于空白样品中添加低（0.1 μg/g）、中（0.5 μg/g） 和高（1.0 μg/g） 3 个水平标准溶液，按1.3 中方法进行样品前处理，取6 次试验结果的平均值计算加标回收率和精密度。

22 种非法添加违禁药物的标准曲线、相关系数、检出限、定量限、回收率和相对标准偏差（n=6） 见表2。

22 种非法添加化学药物的回收率介于77.15%～117.62%，相对标准标准偏差（RSD） 为0.05%～10.65%（n=6），满足日常检测的要求。

2.5 实际样品的测定

在市场随机购买专项保健食品10 种，利用该方法进行检测，发现其中一款壮阳类液体保健食品中红地那非和西地那非有较低剂量检出，含量分别为0.073 μg/g 和0.10 μg/g。可见保健食品市场非法添加现象较为普遍，市场监督管理局应予以高度重视。

3 结论

采用甲醇-水超声提取，建立了高效液相色谱-串联质谱法同时测定液体保健食品中22 种非法添加的违禁药物。该方法前处理简单、分析时间短，检出限、精密度和回收率均能满足实验检验工作，在快速、准确地对保健品中常见的降压药和壮阳抗疲劳类等非法添加药物进行同时测定，大大提高了日常检验的工作效率，为加强保健食品市场的监管和检验提供了重要的技术支撑。

表2 22 种非法添加违禁药物的标准曲线、相关系数、检出限、定量限、回收率和相对标准偏差（n=6）