蛋壳残留蛋清中溶菌酶高效提取技术的研究

李逢振

（湖南环境生物职业技术学院生物工程学院，湖南衡阳 421005）

蛋壳残留蛋清中溶菌酶高效提取技术的研究

李逢振

（湖南环境生物职业技术学院生物工程学院，湖南衡阳 421005）

蛋壳残留蛋清占蛋壳质量的27.6%～30.8%，蛋清中含有0.2%～0.4%的溶菌酶。通过一系列的分离提取工艺可从蛋清中获取溶菌酶。溶菌酶是一种天然蛋白质，对人体无毒害作用，且具有抑菌、消炎、抗病毒等功能，可广泛应用于医药制剂、食品防腐和生物工程领域。对溶菌酶的性质和应用进行了阐述，介绍了蛋清溶菌酶分离提取方法，为进一步开发利用蛋清溶菌酶资源提供了科学依据。

蛋壳；蛋清；溶菌酶

0 引言

溶菌酶又称胞壁质酶，或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种能水解致病菌的糖苷水解酶，其酶解主要作用于微生物细胞壁，而不影响其他组织。因此，也是一种安全无毒的蛋白质。溶菌酶广泛存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的乳汁、唾液、血液、尿液、白细胞及其他体液和组织细胞内，其中以鸟类和家禽蛋清中溶菌酶含量最为丰富，为0.2%～0.4%[1]。目前，市面上销售的多数商品溶菌酶就是从蛋清中提取纯化的。

我国是传统的禽蛋生产大国，拥有极为丰富的禽蛋资源。据国家统计局公布的统计资料数据显示，2016年我国禽蛋产量已突破3 000×104t。蛋品加工企业和广大消费者在利用禽蛋的时候往往都只取用了蛋黄、蛋清等可食部分，而蛋壳则被当作废物扔弃，造成了环境污染，这些蛋壳中残留了大量的蛋清，占蛋壳质量的27.6%～30.8%[2]。由此可见，如果不对蛋壳及时处理，既严重污染生态环境，又造成蛋清资源的浪费。

1 溶菌酶的性质与应用

早在1907年，Nicolle发现在枯草芽孢杆菌的溶液中存在一种未知的溶解子，这是人类第1次接触溶菌酶这种物质。1922年，Fleming等人发现在人的眼泪、唾液中存在能够溶解细菌细胞壁进而杀死细菌的酶，并命名为溶菌酶。商品溶菌酶一般为白色或微白色粉末状物质，易溶于水，不溶于乙醚和丙酮，pI值为11.00～11.35，最适pH值为6.5。其在酸性介质中可稳定存在，而在碱性介质中易失活。

溶菌酶能够水解细胞壁肽聚糖结构中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的β-1,4糖苷键[3]，因此可以溶解大多数革兰氏阳性菌的细胞壁而具有溶菌作用，其对一些革兰氏阴性菌（如大肠杆菌和伤寒沙门氏菌）也具有较强的溶解作用。由此可见，溶菌酶的抗菌谱较广。同时，溶菌酶作为一种天然蛋白质，对人体无毒害作用，具有抑菌、消炎、抗病毒等功能，能在胃肠内起到帮助消化、吸收的作用，并能提高机体免疫力，是一种安全性较高的食品保鲜剂、营养保健品和抗菌消炎类药品。同时，由于其在弱酸性环境下也能保持较强的活力，因此可作为防腐剂应用于低酸食品中。另外，还是基因工程、细胞工程中细胞融合操作必不可少的工具酶[4]，用来提取微生物细胞内各类物质，以及进行原生质体制备及融合育种。

2 蛋壳残留蛋清溶菌酶的提取方法

目前，国内外从蛋壳残留蛋清中提取溶菌酶时，将收集的蛋壳利用蛋壳处理机使蛋壳与残留蛋清分离、过滤，然后采用直接结晶法、离子交换法、亲和色谱法和超滤法等方法，从蛋清中分离提取溶菌酶。

2.1 直接结晶法

溶菌酶是一种较为稳定的蛋白质，具有较强的耐热、耐酸特性，在盐溶液中也具有较好的稳定性，通过改变环境pH值，可以使其以晶体形式析出，从而可以利用这一特性将溶菌酶与蛋清进行分离。1945年Alderton G等人[5]提出采用直接结晶法制备溶菌酶，通过向蛋清中加入一定量的氯化物、碘化物或碳酸盐等中性盐，并使用氢氧化钠调节溶液pH值至9.5～10.0，再逐步降低反应体系温度至4℃，放置2周时间，溶菌酶就会以结晶形式慢慢析出，而大多数蛋白质仍然存留在溶液中，从而将溶菌酶从蛋清中分离出来。但是，采用直接结晶法分离出来的溶菌酶纯度较低，因此需要采用重结晶的方法对分离出的溶菌酶初品进行提纯。采用直接结晶法分离提取溶菌酶具有操作简单、设备要求低、反应条件温和、成本低等优点，是目前以蛋清为原料分离提取溶菌酶的主要方法。

2.2 离子交换法

离子交换法是利用离子交换剂与溶液中的离子之间所发生的交换反应进行物质分离的操作技术。2001年，李宗孝等人[6]采用724型树脂提取鸡蛋清溶菌酶，搅拌吸附后用1%的硫酸溶液洗脱，溶菌酶得率为0.14%。2002年，林亲录等人[7]采用732型树脂纯化溶菌酶，研究了不同pH值对溶菌酶提取效果的影响。2003年，宋宏新等人[8]采用724型树脂提取溶菌酶，装柱后抽提液缓慢流入柱中，先用缓冲液洗涤，再用硫酸铵洗脱，使得724型树脂对溶菌酶的吸附率提高到83.5%。2007年，Bayramoglu G等人[9]用反相悬浮法制备了聚甲基丙烯酸接枝壳聚糖阳离子交换色谱填料来分离蛋清中的溶菌酶，并探索了树脂吸附溶菌酶过程的动力学模型，用HPLC测定洗脱液中溶菌酶的纯度达到94%。采用离子交换法分离提取溶菌酶具有操作简便、高效、成本低和可自动化连续生产等优点，适用于溶菌酶的工业化生产。

2.3 亲和色谱法

20世纪80年代末发展起来的亲和色谱技术是利用物质的亲和能力，将不溶性的载体与可逆结合的配体相偶联，所制成的分离介质具有特异亲和性，能选择性地吸附生物活性物质，根据待分离物质的特性，选择相应组成的溶液进行洗脱，从而达到分离提取所需物质的目的。2001年，Vaidya A A等人[10]采用酸单体与N-异聚丙烯酰胺共聚物从蛋清中热沉淀溶菌酶，收率达到90%。2007年，Lu A X等人[11]制备了一种新型的固定化Fe3+胶原纤维基质吸附剂，用这种吸附剂对溶菌酶进行吸附研究，得到溶菌酶纯度达到100%。采用亲和色谱法分离提取溶菌酶具有快速、高效等优点，能对蛋壳残留蛋清中的溶菌酶进行高效分离与纯化。

2.4 超滤法

超滤法是通过控制超滤膜孔径大小，在压力的作用下将不同分子量的混合物溶液进行分离，从而获得目标产物。超滤法是一种对新型的分离技术，其与传统分离技术相比具有产品得率高、杂质少、纯度高等优点。蛋清中含有卵白蛋白、卵铁传递蛋白、卵黏蛋白、卵类黏蛋白和卵球蛋白等几种主要蛋白质，与其相比溶菌酶的分子量远小于上述蛋清中几种主要蛋白质的分子量，因此可用超滤法将溶菌酶从蛋清蛋白中分离出来。2000年，Ghosh R等人[12]采用小型中空纤维超滤系统从蛋清干粉中分离溶菌酶，溶菌酶选择性透过膜，而其他大分子蛋白质被膜所截留。

3 结语

溶菌酶是一种天然、安全无毒的蛋白质，具有广阔的应用前景。利用蛋壳中的残留蛋清来分离提取溶菌酶，既解决了蛋壳中残留蛋清污染环境的问题，又充分挖掘了残留蛋清潜在的利用价值，有效降低了鸡蛋溶菌酶的生产成本。上述几种分离方法虽各具优点，但仍然存在一些不足之处。因此，要不断拓宽研究思路，优化现有分离提取工艺，积极探索新的分离提取方法。

[1]左胜，吴佳欢，廖志勇.蛋清溶菌酶分离纯化研究进展 [J].科协论坛（下半月），2013（3）：73-74.

[2]杜利成.试论鸡蛋壳及其综合利用 [J].四川食品与发酵，2000（4）：10-13.

[3]林翠花，肖素荣，孟庆国.溶菌酶结构特点及其应用[J].潍坊学院学报，2005（2）：108-110.

[4]史小利，李宗谦，徐淑霞，等.蛋清溶菌酶提取工艺研究 [J].现代农业科技，2008（6）：166-168.

[5]Alderton G，Ward W H，Fevold H L.Isolation of lysozyme from egg white[J].Bio.I Chem，1945（1）：43-58.

[6]李宗孝，原春兰，张建超.蛋清中溶菌酶的提纯研究[J].精细化工，2001，18（2）：103-105.

[7]林亲录，马美湖，金阳海，等.鸡蛋卵清中溶菌酶的提取与纯化 [J].食品科学，2002，23（2）：43-45.

[8]宋宏新，薛海燕，杨芳.鸡蛋壳溶菌酶分离纯化工艺研究 [J].食品工业科技，2003（9）：60-63.

[9]Bayramoglu G，Ekici G，Besirli N，et al.Preparation of ion-exchange beads on poly(methacylic acid）brush grafted chitosan beads：Isolation of lysozyme from egg white in batch system[J].Colloids and Surfaces A，2007（5）：68-77.

[10]Vaidya A A，Lele B S，Deshmukh M V，et al.Design and evaluation of new ligands for lysozyme recovery by affinity thermoprecipitation[J].Chemical Engineering Science，2001（7）：5 681-5 692.

[11]Lu A X，Liao X P，Zhou R Q，et al.Preparation of Fe3+-immobilized collagen fiber for lysozyme adsorption[J].Colloids and Surfaces A，2007（2）：85-93.

[12]Ghosh R，Silva S S，Cui Z F.Lysozyme separation by hollow-fiber ultrafiltration[J].Biochemical Engineering Journal，2000 （6）：19-24.◇

Study on the Efficient Extraction of Lysozyme from Egg White

LI Fengzhen
（College of Bioengineering，Hu'nan Environment Biological Polytechnic，Hengyang，Hu'nan 421005，China）

The residual eggshell quality accounts for 27.6%～30.8%of egg white，egg white lysozyme containing 0.2%～0.4%.The process can be obtained through separation of lysozyme from egg white lysozyme.A series of extraction is a kind of natural protein，it has no toxic effects on the human body，and has antibacterial，anti-inflammatory，anti viral and other functions，can be widely used in the field of pharmaceutical preparation the preservation of food and biological engineering.In this paper，the properties and applications of lysozyme were described，introduced the lysozyme extraction method provides a scientific basis for further development and utilization of lysozyme resources.

eggshell；egg white；lysozyme

Q956

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.12.043

1671-9646（2017） 12b-0057-02

2017-09-29

湖南环境生物职业技术学院院长青年基金项目（Z2013-1）。

李逢振（1983— ），男，硕士，副教授，研究方向为畜产品加工和畜禽废弃物综合利用。