京尼平交联乳清蛋白和壳聚糖膜的制备

李 媛，吕 佳，徐雨春，薛海燕

（陕西科技大学，陕西西安 710021）

京尼平交联乳清蛋白和壳聚糖膜的制备

李 媛，吕 佳，徐雨春，*薛海燕

（陕西科技大学，陕西西安 710021）

以乳清蛋白和壳聚糖为原料制备复合膜，同时利用天然无毒的京尼平作为交联剂，研究其制备工艺。通过单因素试验研究成膜材料比例、热处理温度、塑形剂、交联剂对乳清蛋白和壳聚糖复合膜性能的影响，并对复合膜进行表征和抑菌性研究。结果表明，京尼平可以作为交联剂用来制备乳清蛋白和壳聚糖复合膜，并且可以较好地改善复合膜的拉伸性能和阻隔性能，膜制备的最佳工艺条件是乳清蛋白（WPC） 与壳聚糖（CS） 配比为6∶4，甘油添加量4%，热处理温度70℃，京尼平添加量0.4%，此时复合膜的拉伸强度（TS） 1.79 MPa，断裂伸长强度（E）30.28，透光率（T） 37%，水蒸气透过率（WVP） 1.25，溶解性（S） 34%。在此条件下制得的复合膜具有良好的阻隔性能、抗拉强度、致密性和抑菌性能，可用于食品保鲜和抗菌内外包装的使用。

乳清蛋白；壳聚糖；京尼平；交联剂；抗菌性；表征

环境保护是21世纪人们普遍关注的热点话题之一，采用生物可降解材料作为食品及其他产物的包装是解决包装材料的环境污染问题行之有效的方法。乳清蛋白是由干酪生产过程中所产生的副产品乳清，经过一定工艺浓缩精制而成的高蛋白质，占乳蛋白质的18%～20%，具有很高的营养价值、生产利用价值，也有许多优良的功能特性，最为突出的是成膜性。乳清蛋白能够形成柔软、透明、不溶于水、富有弹性的薄膜，并且具有良好的成膜特点。例如，乳清蛋白在低湿度下对于氧气、油脂和芳香物质有良好的阻隔性。通过查阅大量文献资料了解到，乳清蛋白可食用膜目前的应用面还很窄，主要是用于涂膜保鲜。细究其难以被大量应用在生产中的原因主要是乳清蛋白膜较脆、防潮阻湿性能较差、耐水性不好、抑菌防腐效果差、不具有保健功能等，难以适应食品包装多功能性的要求。

壳聚糖是由几丁质经过脱乙酰作用得到的一种物质。其作为生物保鲜剂，无味、无毒、无害，是一种良好的成膜材料。壳聚糖经化学、物理方法的修饰，可以做成可食用的保鲜膜。壳聚糖膜能够降低蔬菜水果的呼吸作用，抑制微生物的生理生化变化，延长货架期，可以看作一种天然食品抗菌剂。经过试验研究证明，这类薄膜能够阻隔食物与空气接触，在食品保鲜、抑菌防腐等方面都明显优于传统保鲜方法，现在已在一些蔬菜水果上进行了试验和使用。

试验将乳清蛋白和壳聚糖这2种成膜材料共混复合，以期克服单一组分可食用膜在实际应用中不可避免的问题，如阻隔能力不稳定、机械强度低等，并加入京尼平作为交联剂来优化复合膜的最佳制备条件，从而获得具有优良成膜性能和理化性质、高效抗菌性能的功能性复合膜。同时，对复合膜的结构进行表征，揭示乳清蛋白和壳聚糖组分的相容性和京尼平的交联性及复合膜的微观结构的变化规律，从而为京尼平对乳清蛋白和壳聚糖复合膜的实际应用提供参考。

交联剂对于膜的性能非常重要，常用的化学交联剂有戊二醛、三聚磷酸钠和甲醛等。然而，这些常用的化学交联剂都有一定的毒性[1]。京尼平是一种是从天然栀子苷经β-葡萄糖苷酶水解后的天然交联剂，其本身具有优良的药理价值，如保肝利胆、抗炎、抗菌、抗肿瘤、治疗胃炎、治疗糖尿病等。这种天然的交联剂比常用的交联剂（如戊二醛）的毒性小10 000倍[2]。试验使用京尼平作为交联剂来优化复合膜，考查乳清蛋白、壳聚糖二者复配比例，以及成膜影响因素（如增塑剂甘油比例、热处理温度、交联剂比例）对成膜特性的影响。为今后乳清蛋白复合膜和京尼平的使用提供一定的理论和实践基础。

1 试验方法

1.1 复合膜的制备方法

1.1.1 乳清蛋白溶液热改性

称取一定质量的乳清蛋白，使其充分溶解于蒸馏水中，放置于90℃水浴中改性25 min，在加热过程中要用玻璃棒一直搅拌并保持搅拌方向不变，改性之后将乳清蛋白溶液置于45℃水浴中备用。

1.1.2 壳聚糖溶液的制备

将一定质量的壳聚糖溶解于2%的乙酸溶液中，于45℃条件下置于磁力搅拌，使壳聚糖充分溶解。

1.1.3 混合膜液的制备

将改性后的乳清蛋白溶液冷却至室温（23℃），在高速旋转搅拌器上，缓慢将乳清蛋白液注入充分溶解的壳聚糖溶液中并继续搅拌。待膜液充分混合后，缓慢加入增塑剂甘油。

1.1.4 调节pH值

用乙酸缓冲液调节pH值3.5～5.5。

1.1.5 真空脱气

将膜液真空抽气处理10 min，以消除气泡。

1.1.6 铺膜干燥

取15 mL膜液，涂膜于10 cm×10 cm大小相同的有机玻璃板上，喷涂京尼平溶液。于室温下干燥24 h。

1.1.7 揭膜保存

干燥冷却后揭膜，置于相对湿度50%的箱内平衡48 h备用。

1.2 复合膜基础性能的测定

1.2.1 膜的厚度（FT）

采用接触法测定可食膜的厚度，用螺旋测微器在膜表面四角各取1点，中央取1点，共5个点测定膜厚，取平均值，单位为（mm），膜厚用于计算膜的其他性能。

1.2.2 机械性能的测定（TS.E）

用电子拉伸试验机测定其抗拉强度，每个样品大小为2.54 cm×10 cm。确定其拉抗强度（TS） 和断裂伸长率（E）。

1.2.3 透光率测定（T）

将复合膜液置于比色皿中，在400 nm波长处用紫外分光光度计测量，以乙酸作为对照。每批3个平行样，每个样重复进行3次。

1.2.4 溶解度（S） 的测定

参照ASTM（D664-94，1994），取膜样，称质量为m1，然后在105℃的条件下干燥至恒质量，称其质量m2。根据干质量和湿质量之差计算含水量。

1.2.5 水蒸气透过率的测定（WVP）

将复合膜裁剪成圆形放入水蒸气透过率仪中[3]，用TSY-T1L透湿性测试仪测定水蒸气透过系数，测定3组数据，取平均值。

1.3 复合膜的抑菌研究

培养基配制按照国标《食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂》；（GB/T 4789.28—2003）[4]，将牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化钠5.0 g，琼脂粉12 g，加入1 000 mL蒸馏水中，加热溶解后，用0.1 mol/L NaOH溶液调节pH值，使灭菌后pH值在7.2～7.4，分装后置于压力蒸汽灭菌器内，于0.1 MPa，121℃条件下高压灭菌15 min。

采用纸片扩散法测定复合膜的抗大肠杆菌性能。用微量移液管将0.1 mL菌浓度为105CFU/mL的大肠杆菌菌悬液导入营养琼脂培养基，用无菌三角棒涂布均匀，通风干燥15 min，将直径约6 mm的无菌滤纸片置于平板培养基中央，分别滴入添加不同浓度壳聚糖的抗菌膜液，在37℃下培养24 h和48 h，观察并测量抑菌直径。每个样品做3组平行试验。以添加不含壳聚糖复合膜液为空白对照组[5]。

（1）菌种贮藏。大肠杆菌菌种和金黄色葡萄球菌接种于营养琼脂培养基斜面上，在37±1℃培养箱内培养24 h后，置于4℃下贮藏，作为斜面贮藏菌。

（2）菌种活化。将斜面贮藏菌转接到营养琼脂培养基上，在37±1℃培养箱内培养24 h后再进行转接，取连续转接2次以上的新鲜细菌培养物备用。

（3）菌悬液制备。取5.0 mL稀释液加入到活化后的菌种培养基中，轻轻振荡，使菌种分散，吸取3.0 mL稀释液加入营养琼脂培养基斜面试管内，反复操作，再将洗液移至另一支无菌试管中，轻轻振荡数次，得到均匀悬浮的大肠杆菌菌悬液待用。

2 结果分析

2.1 材料复配比例对复合膜机械强度的影响

成膜材料配比对复合膜拉伸强度的影响见图1，成膜材料配比对复合膜断裂伸长率的影响见图2。

图1 成膜材料配比对复合膜拉伸强度的影响

图2 成膜材料配比对复合膜断裂伸长率的影响

随着WPC-CS膜中壳聚糖配比的逐渐增大，可食膜的抗拉强度（TS）呈现先增加后减小再增加的趋势。断裂伸长率（E）见图2呈现先增大后减小的趋势。当复合膜中壳聚糖含量较多时，壳聚糖中的羟基与乳清蛋白中的氨基和羧基形成稳定的化学键，使得复合膜拉伸强度较大，但随着乳清蛋白含量逐渐增多，乳清蛋白分子间作用力增强，取代了乳清蛋白和壳聚糖之间的共价键及氢键，导致复合膜拉伸强度变小。WPC-CS膜的断裂伸长率（E）随着WPC和CS配比的增大而先增大后减小，这是因为WPC和CS分子间结合位点有限，当二者充分结合即比例为6∶4时，此时的拉伸强度为1.72 MPa，分子间连接最紧密。

2.2 材料复配比例对复合膜透光率的影响

复合膜透光率可以反映物质成分的相容性，若复合膜透光率很低，则说明其中的物质相容性差。

成膜材料配比对复合膜透光率的影响见图3。

图3 成膜材料配比对复合膜透光率的影响

由图3可知，随着成膜材料配比的增大，透光率（T）稍微减小，但是差异并不明显，这是因为乳清蛋白与壳聚糖分子通过氢键结合时，连续相和分散相界面发生光反射和散射，导致透光率减小。

2.3 材料复配比例对复合膜阻隔性能的影响

成膜材料配比对复合膜水蒸气透过率的影响见图4。

图4 成膜材料配比对复合膜水蒸气透过率的影响

WPC-CS膜的水蒸气透过系数（WVP） 随着成膜材料配比的增大而先减小后增大。膜的WVP与成膜材料的极性基团密切相关，在CS浓度较高时，WPC-CS膜的WVP较小，随着WPC∶CS的增大，WPC分子与CS分子以氢键等相互作用在有限的结合位点充分结合，使复合膜结构紧密，当达到6∶4时，WVP最小为1.21。随着CS加入量的增大，使阻水性变弱，使复合膜的透水性增强。

2.4 增塑剂添加量的影响

试验证明在未加入增塑剂时，可食用复合膜较脆、易断裂，甚至不能完整地揭膜。在添加低浓度的增塑剂时，复合膜的性能都有很大提升。以甘油为增塑剂的可食用复合膜。随着甘油浓度的增加，复合膜的拉伸强度（TS）显著增加，在4%达到最大为1.72 MPa。

增塑剂对复合膜拉伸强度的影响见图5，增塑剂对复合膜断裂伸长率的影响见图6。

复合膜断裂伸长率（E）在不断增加，这说明甘油的添加对复合膜的柔韧性有了较大提升。在甘油添加量为8%时复合膜的断裂伸长率最大为41.13 MPa。可是在揭膜过程中，由于黏度过大而不易揭膜。为考虑揭膜成度和膜的拉伸效果，应选取4%的甘油添加量为最佳。

2.5 热处理温度对复合膜的影响

热处理温度对复合膜拉伸强度的影响见图7，热处理温度对复合膜阻隔性能的影响见图8。

图5 增塑剂对复合膜拉伸强度的影响

图6 增塑剂对复合膜断裂伸长率的影响

图7 热处理温度对复合膜拉伸强度的影响

图8 热处理温度对复合膜阻隔性能的影响

由图7可以看出，随着热处理温度的升高，膜的整体拉伸强度（TS）先减小后增大。当热处理温度为70℃时，复合膜的拉伸强度达到最大，为30.14 MPa。

由图8可以看出，复合膜的WVP随着热处理温度的升高而下降，当温度到60，70℃时WVP没有显著的改变，这是由于乳清蛋白和壳聚糖分子在适当的加热温度下能更好地交联，提高其阻隔水蒸气的性能。

2.6 交联剂对膜改性的影响

京尼平对复合膜拉伸强度的影响见图9。

图9 京尼平对复合膜拉伸强度的影响

由图9可以看出，以京尼平作为交联剂，对复合膜的拉伸强度（TS）有所增强。可能是由于促进乳清蛋白和壳聚糖的交联作用，使复合膜分子结构更加紧密，透光性和复合膜的光滑性有所增加。而对韧性影响不大，故伸长率变化不大。由于复合膜结构更加紧致，透水性有所减弱。

2.7 复合膜抑菌效力的测定

不同配比壳聚糖的抑菌效果见表1，添加京尼平的抑菌效果效果见表2。

表1 不同配比壳聚糖的抑菌效果

表2 添加京尼平的抑菌效果效果

由表1可以看出，乳清蛋白、壳聚糖复合凝胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用。乳清蛋白和壳聚糖复合膜中对革兰氏细菌有抑菌效力的主要成分是壳聚糖，随着壳聚糖成分的增加，抑菌直径变大，抑菌效果逐渐增大。证明此复合膜有一定的抑菌性，且对大肠杆菌的抑菌能力强于金黄色葡萄球菌。

由表2可以看出，添加京尼平对复合膜的抑菌效果影响不大，增加添加量后抑菌直径没有明显变化。故复合膜抑菌效果的强弱主要依靠壳聚糖的配比。壳聚糖配比越大，复合膜的抑菌性越强。

3 结论

将乳清蛋白和壳聚糖作为原料制备复合膜，同时探究以京尼平作为交联剂制备复合膜时的最优条件。利用抑菌试验，检验复合膜对革兰氏细菌的抑菌作用，生产出具有抑菌性的功能复合膜。最后对复合膜进行表征，更加形象地反映出复合膜的结构特征。

根据试验数据分析，复合膜制备的最佳工艺条件为乳清蛋白与壳聚糖的配比6∶4，甘油添加量4%，热处理温度70℃，京尼平添加量0.4%。该复合膜可作为新型的生物材料，并对新型交联剂的使用和发展提供了参考和理论依据。

[1]Welsh E R， Schauer C L， Qadri S B， et al.Chitosan cross-linking with a water-soluble，blocked diisocyanate.1.Solid state[J].Biomacromolecules，2002，3 （6）：1 370-1 374.

[2]Jin J，Song M，Hourston D J.Novel chitosan-based films cross-linkedby genipin with improved physical properties[J].Biomacromolecules，2004，5 （1）：162-168.

[3]贾艳菊，马同锁，刘坤，等.不同壳聚糖抗菌膜对草鱼保鲜效果的比较 [J].中国农学通报，2010，26（5）：337-340.

[4]Atarés L，Bonilla J.Chiralt A.Characterization of sodium caseinate-based edible films incorporated with cinnamon or ginger essential oils[J].Journal of Food Engineering，2010 （18）：1-10.

[5]石磊，王世平，顾介明.不同浓度壳聚糖膜对葡萄保鲜效果的研究 [J].山东农业科学，2009（8）：99-101.◇

The Preparation of Whey Protein and Chitosan Composite Films Crosslinking by Genipin

LI Yuan，LV Jia，XU Yuchun，*XEU Haiyan
（Shaanxi University of Science and Technology，Xi'an，Shaanxi 710021，China）

In this paper，whey protein and chitosan composite membrane preparation process were studied with taking advantage of natural non-toxic genipin as a crosslinking agent.The proportion of two film-forming materials，influence of thermal denaturation temperature，and shaping and crosslinking agent of whey protein/chitosan composite membrane performance were explored through the single factor experimental study.And we do bacteriostatic study of the composite film.The results showed that geniposidic whey protein could be used as a crosslinking agent and chitosan composite membrane preparation used.And could better improve the tensile properties and the barrier properties of films.The optimum conditions for preparation of the film was derived from whey protein ratio（WPC） ∶chitosan （CS） 6∶4，glycerol concentration 4%，heat treatment temperature 70℃，geniposidic concentration 0.4%，the tensile strength of the composite film（TS） was 1.79 MPa，elongation at break strength（E） was 30.28，the light transmittance（T） was 37%， the water vapor transmission rate（WVP） was 1.25 and solubility（S） 34%.Under these conditions，the resulting composite film had good barrier properties，tensile strength，density and antibacterial properties.It could be used for food preservation and antimicrobial outside packaging.

whey protein；chitosan；genipin；cross-linking agent；antibacterial；characterization

O636.1

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.11.002

1671-9646（2017） 11a-0006-04

2017-07-17

陕西省教育厅专项项目（16JK1101）；陕西科技大学大学生创新创业训练计划项目（008）。

李 媛（1996— ），女，在读本科，研究方向为食品科学。

*通讯作者：薛海燕（1979— ），女，博士，副教授，研究方向为乳品质量安全与控制。