虾夷扇贝裙边糖胺聚糖的提取及其体外抗氧化活性研究

刘雨博，栾君笑，佟长青，李 伟，金 桥

（大连海洋大学食品科学与工程学院，辽宁省水产品加工及综合利用重点开放实验室，辽宁大连 116023）

虾夷扇贝裙边糖胺聚糖的提取及其体外抗氧化活性研究

刘雨博，栾君笑，佟长青，李 伟，*金 桥

（大连海洋大学食品科学与工程学院，辽宁省水产品加工及综合利用重点开放实验室，辽宁大连 116023）

以虾夷扇贝裙边为原料，采用复合蛋白酶进行酶解，研究糖胺聚糖的最佳提取工艺条件及其体外抗氧化活性。结果表明，酶解虾夷扇贝裙边提取糖胺聚糖的最优工艺条件为提取时间3.0 h，酶添加量0.8%，提取温度50℃，料液比1∶2，糖胺聚糖提取率为1.27%。体外抗氧化试验结果表明，提取的虾夷扇贝裙边糖胺聚糖具有较好的抗氧化活性，可清除·OH，O-2·，DPPH·，其清除能力与浓度具有显著的量效关系。

虾夷扇贝裙边；糖胺聚糖；提取；抗氧化性

虾夷扇贝（Patinopecten yessoensis） 属软体动物门扇贝科，肉质鲜美、营养丰富，由其干制的扇贝柱是高档的海产品。扇贝裙边是在扇贝加工过程中取出扇贝柱后的下脚料，约占整个扇贝的30%。近年来，我国的扇贝养殖已相当普及，而在加工贝柱的过程中产生了大量的扇贝裙边，这些扇贝加工废弃物只有部分被用于生产饲料、肥料等低附加值产品，甚至有的被当作废料直接丢弃，对其中有价值的成分并未充分利用，不仅浪费资源，还会污染环境。其实，扇贝裙边的营养成分与扇贝柱十分接近[1]，如何深度开发扇贝裙边，对水产品加工综合利用和保护环境有重要意义，也能促进我国水产业的健康发展。

近年来的研究表明，扇贝裙边中含有活性多肽、氨基多糖、不饱和脂肪酸、牛磺酸等多种生理活性物质[2]。糖胺聚糖又称氨基多糖，是氨基己糖和己糖醛酸重复聚合形成的长链不分支多糖，广泛存在于动物体内。海洋贝类的糖胺聚糖具有抗肿瘤[3-8]、抗凝血[9]、降血脂[10]、增强机体免疫力[11-13]、抗病毒[14]等生物活性。试验以虾夷扇贝裙边为原料，对扇贝裙边中糖胺聚糖的提取工艺及体外抗氧化活性进行初步研究，以期为虾夷扇贝的精深加工和综合利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

虾夷扇贝裙边，大连渔大叔海洋食品有限公司提供，放置于冰柜中冷冻备用；胰蛋白酶（1∶250）、碱性蛋白酶（1∶200000），北京索莱宝（Solarbio） 科技有限公司提供；其他化学试剂均为国产分析纯试剂。

BS-110S型分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司产品；UV-1750型紫外分光光度计，岛津仪器（苏州）有限公司产品；GL-21M型离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司产品；HH-A型数显恒温水浴锅，国华电器有限公司产品；HG202-1A型电热鼓风干燥箱，南京实验仪器厂产品；SD-1500型喷雾干燥机，上海沃迪自动化装备股份有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 虾夷扇贝裙边糖胺聚糖的提取

虾夷扇贝裙边用组织捣碎机研磨成糜，将碱性蛋白酶和胰蛋白酶按活力单位7∶3的比例混合作为酶解用复合酶进行酶解，改变温度、pH值、酶添加量和时间等因素，利用正交试验优化提取工艺，样品液离心后，等电点除杂蛋白，冻干后即为虾夷扇贝糖胺聚糖粗品（PYSG）。提取结果以提取率为评价指标，糖胺聚糖含量的测定采用阿利新蓝比色法[15]。

1.2.2 对·OH的清除作用[16]

取10 mL具塞试管11支，各加9 mmol/L的硫酸亚铁溶液1 mL，9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液2 mL，样品组加入一定浓度的多糖溶液2 mL，然后加入8.8 mmol/L的过氧化氢溶液2 mL启动反应，于室温下反应1 h，于波长510 nm处测定吸光度，重复3次，计算其平均值。同时，测定抗坏血酸对·OH的清除作用。

式中：A0——空白对照吸光度；

A1——不同浓度的样品溶液吸光度；

A2——不加双氧水的样品溶液本体吸光度。

1.2.3 对DPPH·的清除作用[17]

称取DPPH·固体2 mg，加入无水乙醇溶解，50 mL容量瓶定容。取10 mL具塞试管11支，样品组各管分别加DPPH·溶液2 mL，以及一定浓度的多糖溶液2 mL，混合均匀后置于暗处反应30 min，于波长517 nm处测定吸光度，重复3次，计算其平均值。同时，测定抗坏血酸清除DPPH·的能力。

式中：A0——空白对照吸光度；

A1——不同浓度的样品溶液吸光度；A2——样品溶液本体吸光度。

1.2.4 对O-2·的清除作用[18]

采用邻苯三酚自氧化法，于10 mL具塞试管中分别加入pH值8.2的Tris-HCl缓冲液4.5 mL，以及一定浓度的多糖溶液1 mL，混匀后于25℃下保温10 min，加入预热的25 mmol/L邻苯三酚0.4 mL，计

由图1可知，当酶解温度在30～70℃变化时，随着酶解温度上升，糖胺聚糖提取率逐渐升高，但当温度达到60℃，提取率达最大值后，再继续提高酶解温度，糖胺聚糖提取率则出现下降。温度过高，可以使酶变性甚至失活。所以，扇贝裙边最适酶解反应温度为60℃。

2.1.2 pH值对复合酶酶解扇贝裙边制备糖胺聚糖的影响

将酶解条件设定为复合酶添加量1.0%，料液比1∶3，pH值分别为5，6，7，8，9，于60℃条件下分别酶解3 h。

pH值对糖胺聚糖提取率的影响见图2。

由图2可知，随着pH值的逐渐升高，糖胺聚糖提取率也随之上升，当pH值为8时，提取率达最大值，之后再升高pH值，糖胺聚糖提取率则出现下降趋势。原因是复合酶中的胰蛋白酶与碱性蛋白酶本身的最适pH值为8～9，pH值过低或过高均会影响酶的活性。所以，扇贝裙边最适酶解反应pH值为8。时、摇匀，准确反应3 min后，加入10 mol/L的HCl溶液0.1 mL，终止反应，以双蒸水为参比，于波长325 nm处测定吸光度，重复3次，计算其平均值。同时，测定抗坏血酸清除O-2·的能力。

式中：A0——空白对照吸光度；

A1——不同浓度的样品溶液吸光度；

A2——水代替邻苯三酚时不同样品溶液本体吸光度。

2 结果与分析

2.1 复合酶酶解虾夷扇贝裙边制备糖胺聚糖单因素条件的影响

2.1.1 酶解温度对复合酶酶解扇贝裙边制备糖胺聚糖的影响

将酶解条件设定为pH值7.5，料液比1∶3，复合酶添加量1.0%，于30，40，50，60，70℃条件下分别酶解3 h。

酶解温度对糖胺聚糖提取率的影响见图1。

图1 酶解温度对糖胺聚糖提取率的影响

图2 pH值对糖胺聚糖提取率的影响

2.1.3 酶解时间对复合酶酶解扇贝裙边制备糖胺聚糖的影响

将酶解条件设定为复合酶添加量1.0%，料液比1∶3，pH值8，于60℃条件下分别酶解1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 h。

酶解时间对糖胺聚糖提取率的影响见图3。

图3 酶解时间对糖胺聚糖提取率的影响

由图3可知，糖胺聚糖提取率随着酶解时间的增加而升高，酶解2.5 h后提取率上升幅度平缓。综合糖胺聚糖提取率和生产成本这2个方面因素，确定酶解时间2.5 h为最佳。

2.1.4 酶添加量对复合酶酶解扇贝裙边制备糖胺聚糖的影响

将酶解条件设定为料液比1∶3，pH值8，于60℃条件酶解2.5 h。复合酶添加量分别为0.6%，0.8%，1.0%，1.2%，1.4%。

复合酶添加量对糖胺聚糖提取率的影响见图4。

图4 复合酶添加量对糖胺聚糖提取率的影响

由图4可知，随着复合酶添加量的提高，糖胺聚糖提取率逐渐升高，当复合酶添加量大于1.0%后其提取率上升幅度平缓。综合糖胺聚糖提取率和生产成本这2个方面因素，确定复合酶添加量1.0%为最佳。

2.1.5 料液比对复合酶酶解扇贝裙边制备糖胺聚糖的影响

将酶解条件设定为复合酶加量为1.0%（质量比），pH值8，于60℃条件下酶解2.5 h。料液比分别为 1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5。

料液比对糖胺聚糖提取率的影响见图5。

图5 料液比对糖胺聚糖提取率的影响

由图5可知，当料液比为1∶3时，糖胺聚糖的提取率达到最大。

2.2 正交试验结果

单因素试验虽然得出了各因素最佳条件，但并没有考虑到各反应条件之间的相互影响，不能简单认为把各单因素试验的最佳结果组合在一起就是整个提取反应的最佳条件，因此需要在单因素试验基础上，以糖胺聚糖提取率为指标采用正交试验对提取工艺进行优化。

以复合酶添加量、酶解时间、酶解温度、料液比进行四因素三水平正交试验，确定酶解的最佳工艺。

正交试验因素与水平设计见表1，正交试验的结果与分析见表2。

表1 正交试验因素与水平设计

表2 正交试验的结果与分析

由极差分析（R值）可知，4个因素对扇贝裙边糖胺聚糖提取率的影响依次为A＞B＞D＞C，优化所得条件为A3B1C1D1，即提取时间3.0 h，复合酶添加量0.8%，温度50℃，料液比1∶2，在此条件下扇贝裙边糖胺聚糖（PYSG）提取率为1.27%。

2.3 扇贝裙边糖胺聚糖体外抗氧化研究

2.3.1 对·OH的清除作用

·OH是活性氧的一种，是体内产生的正常代谢产物，通常情况下，机体处于动态平衡中，一旦平衡被打破，·OH会对机体造成损害，引起疾病[19]。以VC为参照物，研究扇贝裙边糖胺聚糖对·OH的清除作用。

VC和扇贝裙边糖胺聚糖对·OH的清除作用见图6。

图6 VC和扇贝裙边糖胺聚糖对·OH的清除作用

由图6可知，VC对·OH具有很强的清除作用，明显强于虾夷扇贝裙边糖胺聚糖，当其质量浓度达到0.5 mg/mL时，清除率接近100%，之后质量浓度再增加，VC对·OH的清除作用基本不变。在所选的质量浓度范围内，虾夷扇贝裙边糖胺聚糖对·OH具有清除作用，并且随着质量浓度增加，清除作用增强，表明虾夷扇贝裙边糖胺聚糖对·OH的清除能力与质量浓度有明显的量效关系。当糖胺聚糖的质量浓度为8 mg/mL时，·OH的清除率达到最大值为91.84%。

2.3.2 对O-2·的清除作用

O-2·是生物体内主要的氧自由基，是其他活性氧的前体，对生物体内细胞、蛋白酶、不饱和脂肪酸、核酸等物质均能产生影响。而且O-2·可作为自由基链式反应的引发剂，产生活性更强的自由基，对机体造成更大伤害[20]。

VC和扇贝裙边糖胺聚糖对O-2·的清除作用见图7。

由图7可知，VC对O-2·具有很强的清除作用，明显强于虾夷扇贝裙边糖胺聚糖，当其质量浓度达到1.0 mg/mL时，清除率达到90.05%，之后质量浓度再增加，VC对O-2·的清除作用增加缓慢。虾夷扇贝裙边糖胺聚糖对O-2·的清除作用随着质量浓度的增加逐渐增强，具有明显的质量浓度依赖性。在所选的质量浓度范围内，当糖胺聚糖质量浓度为10 mg/mL时，O-2·的清除率达到最大值76.06%。

图7 VC和扇贝裙边糖胺聚糖对O-2·的清除作用

2.3.3 对DPPH·的清除作用

对DPPH·的清除作用可用来衡量物质的抗氧化能力，清除率越高，抗氧化能力越强。抗氧化物质对DPPH·的清除程度与其所能接受的电子数成定量关系，即与该物质的供氢能力相关[21]。

VC和扇贝裙边糖胺聚糖对DPPH·的清除作用见图8。

图8 VC和扇贝裙边糖胺聚糖对DPPH·的清除作用

由图8可知，VC对DPPH·具有很强的清除作用，明显好于虾夷扇贝裙边糖胺聚糖，当其质量浓度达到0.5 mg/mL时，清除率达到96.14%，之后质量浓度再增加，VC对DPPH·的清除作用增加缓慢。在所选的质量浓度范围内，对DPPH·的清除作用随着虾夷扇贝裙边糖胺聚糖质量浓度的增加而逐渐升高，显示出虾夷扇贝裙边糖胺聚糖对DPPH·的清除能力具有明显的浓度依赖性。当糖胺聚糖质量浓度为10 mg/mL时，DPPH·的清除率达到最大值94.38%。

3 结论

采用由碱性蛋白酶和胰蛋白酶组成的复合酶将虾夷扇贝裙边酶解，通过单因素试验和正交试验优化了虾夷扇贝裙边糖胺聚糖的提取工艺为提取时间3.0 h，复合酶添加量0.8%，提取温度50℃，料液比1∶2，经试验验证，糖胺聚糖提取率为1.27%。

虾夷扇贝裙边糖胺聚糖的体外抗氧化活性试验表明，虾夷扇贝裙边糖胺聚糖具有较好的抗氧化活性，对·OH、O-2·、DPPH·的清除能力与质量浓度有显著的量效关系。虾夷扇贝裙边糖胺聚糖来源广泛，无毒副作用，且具有较好的抗氧化活性，可以开发成天然高效的抗氧化剂。因此，试验对于虾夷扇贝的精深加工和综合利用提供了依据。

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Extraction and in Vitro Antioxidant Activities of Glycosaminoglycan from Patinopecten yessoensis Skirt

LIU Yubo，LUAN Junxiao，TONG Changqing，LI Wei，*JIN Qiao
（Key and Open Laboratory of Aquatic Products Processing and Utilization of Liaoning Province，College of Food Science and Engineering，Dalian Ocean University，Dalian，Liaoning 116023，China）

The extraction and in vitro antioxidant activities of glycosaminoglycan from scallop （Patinopecten yessoensis） skirt were studied in this article.The scallop skirt was hydrolyzed by compound protease.The results showed that optimal conditions of enzymolysis of scallop skirt were extraction time 3.0 h，0.8% （mass ratio） of compound protease，extraction temperature 50℃，solid to liquid ratio 1∶2，and the yield of glycosaminoglycan reached up to 1.27%.Glycosaminoglycan from scallop（Patinopecten yessoensis） skirt had a certain degree of antioxidant activities in vitro and exhibited a dose-dependent inhibitory effect on·OH，O-2·，and DPPH·.

Patinopecten yessoensis skirt；glycosaminoglycan；extraction；antioxidative activity

R285

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.11.003

1671-9646（2017） 11a-0010-05

2017-09-13

大连海洋大学科研项目（DHDY20150105）。

刘雨博（1995— ），女，硕士，研究方向为海洋生物资源开发利用。

*通讯作者：金桥（1977— ），男，博士，副教授，硕士生导师，研究方向为海洋生物资源利用。