烟草祖先种及重要野生种叶绿素酶基因 CLH1 的生物信息学分析

赵晨颖，李 晓，梁 淼， 侯 佩

（郑州轻工业大学 食品与生物工程学院，河南 郑州 450000）

0 引言

叶 绿 素 酶 （Chlorophyllase， E.C.3.1.1.14， 简 称Chlase） 水解叶绿素 （Chlorophyll，Chl） 产生脱植基叶 绿 素 （Chlorophyllide， 简 称 Chlide） 和 叶 绿 醇（Phytol）[1]。叶绿素酶是一种固有的膜蛋白，存在于叶绿体光合膜中[2]，该酶在胞质核糖体上合成，并借助叶绿体核糖体上合成的蛋白质因子进入叶绿体膜中，但从 Terpstra 的著作中推断出叶绿素酶主要存在于叶绿体的小膜中，而在大膜中并不活跃[3]。另有研究发现，叶绿素酶存在于类囊体膜中[4]。Chen M C M等人[5]比较不同物种中已知的叶绿素酶序列，发现在这些序列中脂酶基序和催化三联体都高度保守，尤其是编码 N 末端转运肽结构域的序列，可能在其生理功能和细胞定位中起作用。Chlase 在细胞中的定位不同，源于多基因家族、不同导入途径、不同表达模式及翻译后修饰等不同角度的研究[6]。

Chlase 被认为具有糖蛋白的作用，在莱茵衣藻中被证明，其能促进内质网 （Endoplasmic reticulum，ER） 发生糖基化[7]。拟南芥中的 CLH1 还被认为是一种植物损伤控制酶，可调节不同植物防御途径之间的平衡[8]。另外，Chlase 在 Chl 体内平衡中起着重要的作用，不仅在衰老的叶片和成熟果实中，而且在正常绿色叶片和发育中的果实中都检测到了 Chlase的活性[9]。Kariola T 等人[8]已报道了 Chlase 在 Chl 降解和细胞损伤中的生物学功能，提出了叶绿素酶在保护植物组织免受氧化损伤和调节不同植物防御途径激活中的作用。除上述作用外，Chlase 水解 Chl 产生的 Chlide 及其 Chlide 衍生物也被证明具有抗病毒作用[10]，而且，Chou Y L 等人[7]举例介绍了它们在体外的抗氧化、抗诱变和抗癌作用。因此，叶绿素酶不仅具有生物学研究价值，而且具有潜在的工业和农业应用性[11]。

目前，国内外对叶绿素酶的研究主要集中在模式植物拟南芥上，而对烟草属植物叶绿素酶的探索较少，培育烟草优质品种有赖于挖掘烟草祖先种及野生种中的叶绿素酶基因。基于此，从数据库中提取烟草及祖先种、重要野生种中的 CLH1 基因及其编码蛋白序列，并通过生物信息学分析对其功能、基因编辑位点等进行预测，以期为烟草品质育种提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

研究对象包括普通烟草 （Nicotianatabacum） 祖先 种 林 烟 草 （Nicotianasylvestris） 和 绒 毛 状 烟 草（Nicotianatomentosiformis）、 野 生 烟 草 渐 狭 叶 烟 草（Nicotianaattenuata） 和 本 氏 烟 草 （Nicotianabenthamiana）、白肋烟品种 TN90、烤烟品种 K326 和香料烟品种 Basma Xanthi （简称 BX） 的基因组 DNA、mRNA 和氨基酸序列。

1.2 方法

从拟 南 芥 TAIR 数据库 （https://www.arabidopsis.org/） 中获得拟南芥 CLH1 基因及其编码蛋白，并以此为探针，通过同源搜索，从 NCBI 数据库 （https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）、渐狭叶烟草 NaDH 数据 库 （http://nadh.ice.mpg.de/NaDH/）、 SGN 数 据 库（https://solgenomics.net/） 提取烟草祖先种、野生种及普通烟草中的 CLH1 基因及其编码蛋白序列。利用ProtParam （https://web.expasy.org/protparam/） 分 析 蛋白的理化特性；利用 DANMAN 软件对 CLH1 编码蛋白 序 列 进 行 分 析 ； 利 用 SMART （http://smart.embl-heidelberg.de/） 对 结 构 域、互 作 蛋 白 及 功 能 进 行预测；利用 TMHMMM （http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/） 对蛋白跨膜结构进行预测； 利 用 MEME（https://meme-suite.org/meme/tools/meme） 在线预测烟草 属 植 物 CLH1 蛋 白 的 保 守 基 序 ； 运 用 SWISSMODE （https : //swissmodel. expasy. org/interactive） 对CLH1 蛋 白 的 三 级 结 构 进 行 建 模 ； 利 用 PlantCare（http://bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/ht ml/） 预测 NsylCLH1 基因启动子区的顺式作用元件；最 后 ， 利 用 CRISPRdirect （https://crispr.dbcls.jp） 预测 NattCLH1 的基因编辑位点。

2 结果与分析

2.1 烟草及其祖先种、野生种中 CLH1 蛋白的理化特性

以拟南芥 CLH1 蛋白为探针，通过同源搜索，根据得分、对比覆盖率及与 AtCLH1 序列一致程度进行筛选，得到林烟草 （Nicotianasylvestris）、绒毛状烟草 （Nicotianatomentosiformis）、渐狭叶烟草 （Nic-otianaattenuata）、本氏烟草 （Nicotianabenthamiana）、白肋烟 TN90、烤烟 K326 和香料烟 BX 的 CLH1 蛋白序列。利用 ExPASy - ProtParam 在线工具对栽培烟草及其祖先种、野生种中 CLH1 蛋白进行理化特性分析。结果表明，不同烟草属物种和不同栽培烟草类型 （共 7 种） 分子量范围为 27-40 kD，氨基酸数在250～370 个，除香料烟 CLH1 蛋白 （BXCLH1） 和本氏烟 CLH1 （NbenCLH1） 蛋白的分子量和氨基酸数与拟南芥稍有差距，其他均与拟南芥相近；烟草属植物 CLH1 的 pI 值范围为 5.94～9.33，高于拟南芥 pI值；烟草及拟南芥 CLH1 蛋白的半衰期均为 30 h；不稳定指数为 30.59～50.59，其中林烟草 CLH1 蛋白（NsylCLH1） 和 TN90CLH1 蛋白 （TN90CLH1） 小于40，为稳定性蛋白，其他烟草属植物为不稳定性蛋白。

栽培烟草及其祖先种、野生种中 CLH1 蛋白的特征参数见表 1。

表1 栽培烟草及其祖先种、野生种中 CLH1 蛋白的特征参数

2.2 烟草及其祖先种、野生种中 CLH1 氨基酸序列分析

将烟草属植物 CLH1 编码蛋白的氨基酸序列进行比对 （图 1）。结果显示，林烟草 NsylCLH1、绒毛状烟草 NtomCLH1、本氏烟草 NbenCLH1、渐狭叶烟草NattCLH1、 白 肋 烟 TN90CLH1、 烤 烟 K326CLH1 和香料烟 BXCLH1 的一致性为 71.54%，表明其在功能上可能存在差异；其中，TN90CLH1 和 NsyCLH1 序列比对结果完全一致，这也证明了作为白肋烟的母本祖先种林烟草与白肋烟 TN90 的亲缘关系。

多序列比对见图 1。

图1 多序列比对

2.3 烟草及其祖先种、野生种中 CLH1 蛋白的保守基序及结构域分析

利用 MEME 对烟草 CLH1 蛋白序列的保守基序进行在线分析 （图 2），发现除香料烟 CLH1 蛋白中不存在 Motif1，Motif1、Motif2 和 Motif3 在几种烟草CLH1 蛋白中都存在。利用 SMART 对烟草 CLH1 蛋白的功能域进行在线分析，结果显示几种烟草 CLH1蛋白均具有叶绿素酶和叶绿素酶 2 结构域。其中，只有林烟草 CLH1 和 TN90CLH1 的蛋白存在跨膜结构，这与 TMHMM 对烟草 CLH1 蛋白跨膜结构的预测一致 （图 3）。

保守基序分析见图 2，栽培烟草及其祖先种、野生种中 CLH1 蛋白的功能域分析见表 2，NsylCLH1和 TN90CLH1 蛋白的跨膜结构域分析见图 3。

图3 NsylCLH1 和 TN90CLH1 蛋白的跨膜结构域分析

表2 栽培烟草及其祖先种、野生种中 CLH1 蛋白的功能域分析

图2 保守基序分析

2.4 CLH1 蛋白的三级结构预测

利用 SWISS-MODEL，对烟草 CLH1 蛋白进行三级结构建模。基于模板 5xh3.1.A 对 NsylCLH1 和TN90CLH1 进行建模；基于模板 5lul.1.A 对 Ntom CLH1 进行建模；基于模板对 NattCLH1 进行建模；基 于 模 板 对 NbenCLH1 进 行 建 模； 基 于 模 板 对K326CLH1 进行建模；基于模板对 BXCLH1 进行建模。

烟草属植物 CLH1 蛋白的三级结构见图 4。

图4 烟草属植物 CLH1 蛋白的三级结构

2.5 启动子顺式作用元件预测

从 NCBI 数 据 库 中 提 取 NsylCLH1 基 因 上 游 的2000 bp 的片段，运用 PlantCare 对启动子顺式作用元件进行了预测 （表 3），对结果进行分析，发现NsylCLH1 基因启动子中的顺式作用元件主要包括5 类：①与基因表达等相关的组成型元件；②与脱落酸 （ABA）、茉莉酸甲酯 （MeJA）、赤霉素 （GA） 和水杨酸 （SA） 等激素应答相关的元件；③与光响应相关的元件；④与干旱、盐分等逆境胁迫相关的元件；⑤与抗病性相关的元件。

NsylCLH1 启动子的顺式作用元件预测结果见表 3。

表3 NsylCLH1 启动子的顺式作用元件预测结果

2.6 基因编辑位点分析

运用 CRISPR direct 在线网站进行靶标设计，以NGG 为 PAM 序列，以 NtomCLH1 为例，设计该基因的靶位点。从设计结果中选择了 GC 含量适中，脱靶率最低的 2 个位点；2 个靶位点均位于正义链 （+），12 bp 种子序列和 PAM 的搜索项为 1，说明靶位点在整个基因组范围内只有 1 个，20 bp 全长序列和 PAM匹配项为 0，说明该序列可能跨越外显子 - 外显子连接，脱靶概率较高。

CRISPR/Cas9 基因编辑靶位点见表 4，靶位点特异性图解见图 5。

图 5 靶位点特异性图解

表4 CRISPR/Cas9 基因编辑靶位点

3 讨论与结论

叶绿素酶同属于酯酶 / 脂肪酶超家族和 α/β 水解酶家族，对多种植物的研究表明，其蛋白结构的作用不仅体现在光和逆境胁迫中，而且对植物激素信号转导具有重要作用[12]。据报道，在拟南芥中，白光照射下 AtCLH1 和 AtCLH2 基因的产物会急剧增加[13]。将匍匐剪股颖 （AgrostisstoloniferaL.） 暴露于热胁迫温 度 下 35 d， 响 应 热 胁 迫 后 ， 其 叶 绿 素 酶 活 性 增加[14]。在蜜柑 （Citrusunshiu） 中，乙烯能够增强叶绿素酶活性，从而加速叶绿素的降解[15]。在乙烯处理过的柑橘果皮中，赤霉素 （gibberellin A3，GA3） 和苄基腺嘌呤 （benzyladenine，BA） 抵消了部分乙烯诱导的 Chlase 活性的增加。将茉莉酸甲酯 （Methyl jas monate，MeJA） 作用于拟南芥植物时，CLH 基因的表 达 量 达到最 高[4]。 此 外 ， 研 究表 明， 叶绿 素酶 的表达与银杏叶片衰老或果实成熟过程均无关[9]。

利用拟南芥 CLH1 基因及其编码蛋白序列，获取了烟草祖先种、近缘野生种及 3 种不同烟草类型的CLH1 基因及其编码蛋白序列，并对其进行了预测和分析。结果表明，它们在理化特性上存在差异，主要 体现在香料烟 CLH1 （BXCLH1） 和本氏烟 CLH1（NbenCLH1） 的分子量和氨基酸数与其他 5 种有差距；其次，林烟草 CLH1 （NsylCLH1） 和 TN90CLH1（TN90CLH1） 的稳定性与其他 5 种不同。氨基酸序列分析表明这些序列高度相似，其蛋白结构包含了 3 个相同的保守基序。NsylCLH1 基因启动子的顺式作用元件包括抗病性作用元件，也包含干旱和盐分等作用元件，表明该基因的表达可能受到病菌和逆境胁迫的诱导；此外，还含有响应 MeJA、GA、ABA 和SA 等激素的元件，表明该基因的表达会受到多种激素诱导。NsylCLH1 基因启动子中还含有多个光响应元件，暗示了其可能参与光调节的叶绿素降解过程。基因表达的组织特异性或信号响应性通常反映了相应基因产物在植物发育和信号传导中的功能[5]。烟草属植物 CLH1 基因对多种生物和非生物胁迫的响应，对于烟草分子育种和抗逆性育种等工作具有重要的参考价值，同时其基因靶位点的设计也为烟草属植物CLH1 基因编辑提供了理论基础。