响应面优化超声波辅助水酶法提取荸荠多糖

吕雯姣，余兆硕，唐柳欢，嵇宏杰，彭彰文，吴竹青

（吉首大学食品科学研究所，湖南吉首416000）

响应面优化超声波辅助水酶法提取荸荠多糖

吕雯姣，余兆硕，唐柳欢，嵇宏杰，彭彰文，*吴竹青

（吉首大学食品科学研究所，湖南吉首416000）

以荸荠为原料，采用超声波辅助水酶法提取荸荠多糖，探讨超声波辅助条件下提取时间、提取温度、α-淀粉酶添加量和料液比对荸荠多糖提取效果的影响；应用Box-Behnken设计四因素三水平试验，依据响应面分析确定最优的提取工艺条件。结果表明，荸荠多糖最佳提取工艺参数为提取温度56℃，提取时间47 min，料液比1∶14，α-淀粉酶添加量4.4×103U，在此条件下荸荠多糖得率11.95%。

荸荠多糖；超声波辅助；水酶法；工艺条件

荸荠（Eleocharis dulcis） 属单子叶莎草科，主要生长于广西、湖南等地的低洼地区。荸荠的药理作用众多，具有清热解毒、凉血生津、利尿通便、化湿祛痰、消食除胀的功效。据研究报道，在荸荠中所含生物类多糖具有促进人体生长发育、加快体内三大物质（糖、脂肪、蛋白质）代谢、维持生理功能的需要、调节酸碱平衡等功能。

目前，用于荸荠多糖的提取分离方法主要有水提法、乙醇-水溶剂提取法、微波提取法和超声波提取法。近年来，超声波辅助水酶提取法由于提取温度低、操作简便、微量提取效率高、不破坏提取物结构等特点，已被广泛用于天然植物有效成分的提取中[1]。

荸荠多糖的提取工艺受诸多因素影响，各因素间也存在着交互作用。因此，为了得出最优工艺条件，采用超声波辅助水酶法通过单因素和响应面法分析优化试验。对超声波提取温度和提取时间、料液比、酶添加量进行研究，获得响应面法优化超声波辅助水酶法提取荸荠多糖的优化工艺[2]。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

荸荠，购于吉首市农贸市场；α-淀粉酶（2 000 U/g）；葡萄糖、无水氯化钙、苯酚、浓硫酸、正丁醇、三氯甲烷、95%乙醇，均为分析纯试剂。

1.2 试验仪器

722型分光光度计，上海舜宇恒平科学仪器有限公司产品；RE-501A型旋转蒸发器，郑州特尔仪器有限公司产品；101-2AB型电热恒温鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司产品；超声波提取器；HH-S型恒温水浴，江苏金华市医疗仪器厂产品；FDS-series型真空冷冻干燥机，SIMInternational Group产品；LXJ-IIB型飞鸽牌离心机，上海爱奉机电设备有限公司产品。

1.3 荸荠多糖提取工艺流程

1.3.1 材料预处理

取200 g新鲜荸荠，洗净、去皮，切成2～3 mm厚的薄片，于电热恒温鼓风干燥箱中65℃充分烘干，并用研钵粉碎。

1.3.2 工艺流程

荸荠→烘干粉碎、制液→超声波水提→α-淀粉酶去淀粉→高温灭活酶→离心→取上清液（粗提液）→Sevage法脱蛋白→萃取→取上清液→醇析→离心→取下层沉淀→真空冷冻干燥→粗荸荠多糖[3]。

1.4 荸荠多糖得率计算

荸荠多糖得率：

式中：Y——荸荠多糖质量；

m——荸荠多糖质量；

w——荸荠粉末质量。

1.5 试验设计

1.5.1 单因素试验

研究料液比、α-淀粉酶添加量、提取时间和提取温度对荸荠多糖得率的影响，首先做单因素试验考察以上条件对荸荠多糖得率的影响，然后采用响应面法优化最佳工艺条件，作为荸荠多糖提取指标。在不同料液比（1∶10，1∶12，1∶14，1∶16，1∶18，1∶20），不同提取温度（50，55，60，65，70℃），不同提取时间（25，30，35，40，45，50 min）和不同α-淀粉酶添加量（3.6×103U，4.0×103U，4.4× 103U，4.8×103U，5.2×103U）等条件下，考察各个因素对荸荠多糖得率的影响[4-5]。

1.5.2 响应面优化试验

在单因素试验结果的基础上，采用四因素三水平的Box-Behnken响应面试验设计方法，以料液比、α-淀粉酶添加量、提取时间和提取温度为考察因素，以荸荠多糖得率为指标进行优化[6]。

1.6 数据统计与分析

采用Design-Expert软件（Version 7.1 Stat-Ease Inc.，Minneapolis，MN，USA）对响应面试验得到的数据进行线性回归和方差分析，模型及因素的显著性均通过F值考察（p＜0.05），所有试验均需做3个重复[7]。

2 结果与讨论

2.1 荸荠多糖提取单因素试验

2.1.1 提取温度对荸荠多糖得率的影响

提取温度对荸荠多糖得率的影响见图1。

由图1可知，提取温度为55℃时荸荠多糖得率最大。因为提取温度低于55℃时，分子扩散运动小，物料的空化作用不够完全，从而降低了得率；提取温度高于55℃后，由于物料略有糊化，可能使得荸荠多糖得率降低，故选择提取温度为55℃。

图1 提取温度对荸荠多糖得率的影响

2.1.2 提取时间对荸荠多糖得率的影响

提取时间对荸荠多糖得率的影响见图2。

图2 提取时间对荸荠多糖得率的影响

由图2可知，起初荸荠多糖得率随提取时间的增加而增大，当超声处理时间为45 min时达到最大值，之后随提取时间的延长得率逐渐下降。由于超声波作用在开始的时间内对细胞膜的破碎作用比较大，细胞溶出物多，得率不断升高；当溶解度达到饱和时，有效成分不再被溶解，故提取时间选择45 min。

2.1.3 料液比对荸荠多糖得率的影响

料液比对荸荠多糖得率的影响见图3。

图3 料液比对荸荠多糖得率的影响

由图3可知，料液比由1∶10变化到1∶12时荸荠多糖得率逐渐增加，但料液比达到1∶16时得率下降，1∶14时达到最大。这是因为料液比1∶16时，溶液的黏度较大，影响分子扩散速率，使得体系分散不均匀，可能导致局部pH值过高，酶失去活性。

2.1.4 α-淀粉酶酶添加量对荸荠多糖得率的影响

α-淀粉酶添加量对荸荠多糖得率的影响见图4。

由图4可知，α-淀粉酶添加量为4.0×103U时荸荠多糖的得率增加迅速，其原因为加入酶制剂后，可以有效降解植物细胞壁的纤维素骨架，崩溃植物细胞壁，使细胞内有效成分释出，从而提高了多糖得率；随着α-淀粉酶添加量的进一步增加，酶解效果反而下降，其原因可能是酶的竞争性抑制作用，使提取的荸荠多糖分子与α-淀粉酶形成了复合体系，使酶的活力受到了抑制。因此，确定α-淀粉酶添加量为4.0×103U。

图4 α-淀粉酶添加量对荸荠多糖得率的影响

2.2 响应面设计结果与分析

根据单因素试验结果，设定提取温度50～60℃，提取时间40～50 min，料液比1∶12～1∶16，α-淀粉酶添加量4.0×103～4.8×103U，采用Box-Behnken响应面设计法来优化提取条件[8-10]。

Box-Behnken试验设计因素与水平设计见表1，Box-Behnken试验设计与结果见表2，回归模型的方差分析见表3。

表1 Box-Behnken试验设计因素与水平设计

通过分析，可以得到荸荠多糖提取条件与荸荠多糖得率之间的二次多项式模型：

式中：Y——荸荠多糖得率的预测值；

X1——提取温度的编码值；

X2——提取时间的编码值；

X3——料液比的编码值；

X4——α-淀粉酶添加量的编码值。

F检验反映的是回归模型的有效性，包括失拟性检验和回归方程显著性检验。方差分析结果（表3）显示，方程复相关系数的平方R2=0.969 0，说明该模型极显著（p＜0.01），失拟项在0.05水平上不显著；R2adj=0.932 9，说明建立的模型能够解释93.29%响应值的变化，能很好地描述超声波辅助水酶法提取荸荠多糖得率随提取条件的变化规律。因此，该模型具有可行性。

由表3可知，因素X1，X2，X3，X4，X1X3，X2X4，X12，X22，X32，X42对荸荠多糖得率的影响极显著（p＜0.01），X1X4，X3X4对荸荠多糖得率的影响较显著（p＜0.05），X2X3，X1X2对荸荠多糖得率的影响不显著（p＞0.05）。为了便于对模型进行分析讨论，不显著的项没有去掉。

表2 Box-Behnken试验设计与结果

表3 回归模型的方差分析

2.3 二因素间的交互作用分析

由方程（1）所作的响应面及等高线见图5～图8，各因素及其交互作用对响应值的影响结果可通过该组图直观反映出来。等高线的形状反映了交互作用的强弱，椭圆表示两两交互作用显著，圆形则表示交互作用不显著。

2.3.1 提取温度和料液比的交互作用分析

提取温度与料液比响应面和等高线见图5。

图5 提取温度与料液比响应面和等高线

由图5可知，提取温度和料液比的交互作用达极显著水平，将提取时间和α-淀粉酶添加量固定在零水平，可以得到提取温度和料液比对荸荠多糖得率影响的方程：

另可看出，随着提取温度和料液比的增加，荸荠多糖得率增加。但是，提取温度过高、料液比过大都不利于荸荠多糖的析出。所以，提取温度56℃，料液比1∶12～1∶14时，荸荠多糖得率最高。

2.3.2 提取温度和酶添加量的交互作用分析

提取温度与α-淀粉酶添加量响应面和等高线见图6。

由图6可知，提取温度和酶添加量的交互作用达显著水平，将提取时间和料液比固定在零水平，可以得到提取温度和α-淀粉酶添加量对荸荠多糖得率影响的方程：

图6 提取温度与酶添加量响应面和等高线

另可看出，随着提取温度和酶添加量的增加，荸荠多糖得率增加。但是，提取温度过高，α-淀粉酶添加量过大都不利于荸荠多糖的析出。所以，提取温度56℃，α-淀粉酶添加量4.0×103～4.8×103U时，荸荠多糖得率最高。

2.3.3 提取时间和酶添加量的交互作用分析

提取时间与酶添加量响应面和等高线见图7。

图7 提取时间与α-淀粉酶添加量响应面和等高线

由图7可知，提取时间和α-淀粉酶添加量的交互作用达极显著水平，将提取温度和料液比固定在零水平，可以得到提取时间和α-淀粉酶添加量对荸荠多糖得率影响的方程：

随着提取时间和α-淀粉酶添加量的增加，荸荠多糖得率增加。但是，提取时间过长，α-淀粉酶添加量过大都不利于多糖的析出。所以，提取时间46～47 min，α-淀粉酶添加量4.0×103～4.8×103U时，荸荠多糖得率最高。

2.3.4 料液比和酶添加量的交互作用分析

料液比与α-淀粉酶添加量响应面和等高线见图8。

图8 料液比与α-淀粉酶添加量响应面和等高线

由图8可知，料液比和α-淀粉酶添加量的交互作用达显著水平，将提取温度和提取时间固定在零水平，可以得到料液比和α-淀粉酶添加量对荸荠多糖得率影响的方程：

另可看出，随着料液比和酶添加量的增加，荸荠多糖得率增加。但是，料液比过大，α-淀粉酶添加量过大都不利于荸荠多糖的析出。所以提取时间46～47 min，α-淀粉酶添加量4.0×103～4.8×103U时，荸荠多糖得率最高。

2.4 模型的优化和验证

通过分析可以得到最佳的提取条件为提取温度56.37℃，提取时间47.38 min，料液比1∶13.66，酶添加量4.4×103U，荸荠多糖得率可达12.35%。根据实际情况，选择提取温度56℃，提取时间47 min，料液比1∶14，α-淀粉酶添加量4.4×103U，测定荸荠多糖得率为11.95%，与预测值接近，说明该模型可以较好地预测超声波辅助水酶法提取条件与荸荠多糖得率之间的关系，同时也证明了响应面法优化荸荠多糖提取工艺参数的可行性。

3 结论

通过单因素试验考察了提取温度和提取时间、料液比、酶添加量对荸荠多糖得率的影响，将提取温度考查范围定为50～60℃、提取时间考查范围定为40～50 min、料液比考查范围定为1∶12～1∶14、α-淀粉酶添加量的考查范围定为4.0×103～4.8× 103U，通过响应面法分析，建立了超声辅助水酶法提取荸荠多糖得率数学模型回归方程的决定系数0.969 0，方程显著，拟合良好，可以进行实际预测。应用响应面设计法优化出其最佳超声提取条件为提取温度56℃，提取时间47 min，料液比1∶14，α-淀粉酶添加量4.4×103U，最高得率为11.95%，为地区工业化利用丰富的荸荠资源、提取多糖提供了生产数据。同时，采用超声法辅助水酶法从荸荠中提取多糖成分的方法提取速度快，容易实现产业化，具有一定的地区经济价值。

[1]景荣琴，熊清平，景怡.响应面法优化桑葚多糖的超声波辅助提取工艺条件 [J].天然产物与开发，2014（4）：570-574.

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[10]Shi Yun-lai，Chen Chao.Optimal design of butterflyshaped linear ultrasonic motor using finite element method and response surface methodology[J].Journal of Central South University，2013，20：393-404.◇

Optimization of Eleocharis Dulcis Polysaccharides Extraction with Ultrasonic Assistant Aqueous Enzymatic by Response Surface Methodology

LV Wenjiao，YU Zhaoshuo，TANG Liuhuan，JI Hongjie，PENG Zhangwen，*WU Zhuqing
（Institute of Food Science，Jishou University，Jishou，Hu'nan 416000，China）

The effects of ultrasonic-assisted time and temperature，enzyme dosage and ratio of material to liquid on the extraction rate of Eleocharis dulcis polysaccharides are studied with the polysaccharides extracted by the ultrasonic wave-assisted aqueous enzymatic methed.Box-Behnken design with 4 factors and 3 levels test is applied in this experiment，while the optimal process conditions are obtained by regression analysis of response surface methodology.The results show that the optimal extraction conditions are as follows：ultrasonic temperature 56℃，ultrasonic time 47 min，material-water ratio 1∶14，enzyme dosage 4.4×103U.In this optimal process condition，the yield of eleocharis dulcis polysaccharides is 11.95%.

Eleocharis dulcis polysaccharides；ultrasonic assistant；aqueous enzymatic method；technological parameter

TS255.36

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.12.001

1671-9646（2016）12a-0001-05

2016-09-08

吉首大学2014年大学生创新性实验项目（2014ZXCX09）。

吕雯姣（1994— ），女，在读本科，研究方向为植物资源研究与利用。

*通讯作者：吴竹青（1964— ），女，本科，高级工程师，研究方向为植物资源研究与利用。