玉米ZmMYC2基因的克隆及功能分析

杜 明 陈明超 方 玉,2 武健东,*

研究简报

玉米基因的克隆及功能分析

杜 明1陈明超3方 玉1,2武健东3,*

1上海中科荃银分子育种技术有限公司, 上海 200030;2安徽荃银高科种业股份有限公司, 安徽合肥 230088;3安徽农业大学 / 作物抗逆育种与减灾国家地方联合工程实验室, 安徽合肥 230036

植物在生长发育过程经常受到病原菌的侵害, 严重影响作物产量。MYC2属于bHLH家族转录因子, 在茉莉酸介导的信号途径中有着重要的调控作用。在前期工作中, 通过对MYC家族进化树分析, 找到了与拟南芥同源的玉米基因。本研究克隆了, 该基因全长2118 bp, 编码705个氨基酸残基, 其编码蛋白定位于细胞核。RT-qPCR分析表明,在玉米各个组织中均有表达, 但在叶中的表达量最高。诱导表达模式分析表明,可以响应茉莉酸(jasmonic acid, JA)、水杨酸(salicylic acid, SA)和乙烯(ethylene, ETH)的诱导。在50 μmol L–1茉莉酸处理的培养基上, 过表达拟南芥的根长显著短于野生型, 突变体拟南芥的根长显著长于野生型, 回补材料拟南芥根长与野生型无明显差异。对过表达拟南芥材料接种丁香假单胞杆菌(psedumonas syrinage pv.tomato DC3000,DC3000), 野生型、突变体和回补拟南芥相对于过表达表现出较好的状态, 推测降低了拟南芥对病原菌侵害的防御能力。接种前, 外源施加茉莉酸激素, 过表达拟南芥叶片死亡面积和叶内含菌量均有所减少, 茉莉酸激素增强了对病原菌侵害的抵抗能力。亚细胞定位显示, ZmMYC2为核定位蛋白。酵母双杂交表明ZmMYC2可以与JAZ蛋白中的JAZ1和JAZ3相互作用。茉莉酸、水杨酸和防御基因以及细胞程序性死亡基因的表达量分析表明,负调控的表达, 正调控、、以及细胞程序性死亡基因的表达。综上所述, ZmMYC2通过与JAZ1和JAZ3相互作用, 参与茉莉酸信号的转导作用, 降低了拟南芥对病原菌胁迫的抵抗能力。

玉米;; 病原菌防御; 茉莉酸

玉米()是重要的粮食作物和经济作物, 其生长发育经常受到病原菌的影响, 造成玉米产量和品质的下降[1]。植物本身进化出多种防御策略来应对病原菌, 重新编码细胞的代谢, 从而实现最佳的生长发育条件。微生物病原体有2种类型: 一是坏死性病原体, 需要杀死活的宿主细胞以利用腐烂的植物器官作为养分生长[2]; 另一个是生物营养型病原体, 寄生在活的宿主细胞维持其生长和繁殖[3]。一方面, 植物依靠积累水杨酸、茉莉酸、茉莉酸酯及乙烯的等信号分子抵御病原菌; 另一方面, 通过防御相关基因的诱导以及抗菌化合物的产生来抵御病原菌[4-6]。

bHLH转录因子家族在其N端有一个碱性区域b, 与DNA绑定有关, 能够识别E-box元件; 在其C端有1个HLH结构, 由2个同时亲水又亲脂的α螺旋以及1个连接的环所组成。近年来, 对于植物病原菌防御方面研究较多的就是植物中髓细胞组织增生蛋白(myelocyto-matosis, MYCs), 即MYC类转录因子, 其作为植物茉莉酸类激素响应途径中的核心转录因子, 具有多种调节功能[7-8]。病原菌DC3000能够产生JA-Ile结构类似物冠菌素(coronatine, COR)抑制寄主。拟南芥中发现了和突变体根对外源茉莉酸刺激不敏感, 同时发现基因可能还在ABA信号转导途径具有调控作用[9]。MYC2转录因子能够调控根、叶、种子的发育, 还能通过激活茉莉酸信号途径上游相关基因对其进行调控[10]。此外, MYC类转录因子, 通过响应茉莉酸, 来协调水杨酸、乙烯起到对病原菌的综合性抵抗[11-13]。拟南芥中MYC2编码的转录因子的失活完全恢复中防御素的表达, 这意味着干扰了功能以消除对防御素表达的抑制; 此外,突变体中病原菌诱导的的表达在很大程度上挽救了植物中的入侵前抗性反应, 这些结果表明在应对非适应性真菌病原体的抗性反应中起重要的作用, 且部分是通过的功能去阻遏诱导抗真菌蛋白表达[14]。拟南芥参与抵抗病原菌的侵染过程, 调控防御基因的表达, 在抵抗生物和非生物胁迫过程中发挥着重要功能[15]。水稻中,能与JAZ蛋白相互作用对水稻白叶枯病的抗性起到重要的作用[16]。为拟南芥茉莉酸通路中响应昆虫取食的主要调节因子, 专食性菜青虫取食后的拟南芥中,在取食和未取食的叶片中均有表达[17]。拟南芥中,和过表达植株表现出对茉莉酸敏感,和表现出相反的类型[18]。可以与结合, 响应茉莉酸通路, 调控下游病原菌防御基因的表达, 同时, MTB蛋白可以识别MED25和MYC2形成的转录复合体, 作用于JAZ上游阻遏蛋白以及茉莉酸响应基因, 从而调控植物在生长发育和防御反应之间的平衡[19-21]。在生物的进化过程中, 植物和草食性昆虫之间通过相互作用来共同进化[22]。玉米转录因子ZmbHLH91与ZmMYC2相互作用, 作为JAZ蛋白的阻遏物参与茉莉酸信号通路[23]。ZmJAZ4、ZmJAZ8和ZmJAZ12在细胞核中与ZmMYC2相互作用, 证实了ZmJAZ家族蛋白可与茉莉酸信号通路关键转录因子ZmMYC2结合的功能[24]。

在拟南芥和水稻中对MYC2的功能研究的比较明确, 对玉米中参与调节茉莉酸介导的防御机制也在逐步清晰。玉米中,过表达提高了对灰葡萄孢的抗性及调节茉莉酸介导的生长发育和防御反应中有重要的作用[25]。与Z相互作用, 激活玉米萜类植物抗毒素生物合成基因的表达[26]。利用和两个转录因子, 通过模拟昆虫取食反应来说明玉米中茉莉酸信号和的转录调控, 揭示了茉莉酸信号对在食草反应的防御机制[27]。本试验在前期工作中对MYC家族基因分析, 找到了在玉米中的同源基因, 通过克隆该基因并异源过表达转化拟南芥。通过亚细胞定位、DC3000接种处理、茉莉酸激素处理以及筛选与互作的蛋白来明确其功能, 旨在为玉米的品质改良提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 系统进化树和序列分析

玉米MYC家族转录因子序列下载自Maize GDB (https://maizegdb.org/), 其他相关转录因子序列下载自Phytozome (https://phytozome-next.jgi.doe.gov/)或者NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), MYC家族基因对应的基因ID分别为:(GRMZM2G172795)、(GRMZM2G001930)、(GRMZM2G303463)、(GRMZM2G148723)、(GRMZM2 G159937)、(GRMZM2G076636)、(GRMZM2G049229)、(GRMZM5G822829)、AT4G00480.1)、(AT1G32640.1)、(AT5G46760.1)、(AT4G17880.1)、(AT1G 01260.1)、(AT1G10610.1)、(AT1G 63650.1)、(AT2G16910.1)、(AT2G 46510.1)、(AT4G00870.1)、(AT4G 09820.1)、(AT4G16430.1)、(AT5G 41315.1)、(LOC_OS01G13460)、(LOC_ OS10G42430)、(LOC_OS01G50940)、(LOC_OS01G64560)、(LOC_ OS02G02820)、(LOC_OS04G47040)、(LOC_ OS04G 47080)、(Bradi1g54070)、(Bradi1g 54111)、(Bradi1g59771)、(Bradi2g 08080)、(Bradi2g47730)、(Bradi3g 01910)、(Bradi3g34200)、(TraesCS1A02 G102400)、(TraesCS1B02 G112900)、(TraesCS1A02G193200)、(TraesCS1B02G 208000)、(TraesCS1D02 G196900)、(TraesCS2A02G255700)、(TraesCS2B02G 286700)、(TraesCS2D02 G267000)、(TraesCS2A02G409400)、(TraesCS2B02G 428000)、(TraesCS2D02 G406900)、(TraesCS2D02G406800)、(TraesCS4B02G 397400)、(TraesCSU02 G116000)、(TraesCS2D02G575600)、(TraesCS3A02G 158600)、(TraesCS3B02 G185400)、(TraesCS3D02G166300)、(TraesCS3A02G 252900)、(TraesCS3B02 G284800)、(TraesCS3D02G253700)、(TraesCS4A02G 028900)、(TraesCS4B02 G276900)、(TraesCS4D02G275500)、(TraesCS4D02G 224600)、(TraesCS4B02G397800), 用DNAMAN软件进行序列比对, 采用MEGA6.0进行构建进化树。

1.2 试验材料及样品的处理

1.2.1 试验材料 玉米B73自交系、野生型拟南芥()由安徽农业大学作物抗逆育种与减灾国家地方联合工程实验室武健东副教授课题组提供。

1.2.2 组织表达模式 取正常生长的B73玉米根、茎、叶、花丝、苞叶、果穗、果芯、胚和胚乳, 液氮速冻后置于–80℃冰箱。

1.2.3 诱导表达模式 正常培养B73玉米培养至三叶期参照Fu等[28]的方法分别喷施茉莉酸(jasmonic acid, JA)、水杨酸(salicylic acid, SA)、乙烯(ethylene, ETH), 激素处理后取材时间为0、3、6、12、24和48 h, 所有时间段取材均采取相似部位, 液氮速冻后放于–80℃冰箱。

1.2.4 RNA的提取和cDNA的获得 利用TRIzol法提取不同时期的B73玉米的组织的和不同时间段激素处理的B73玉米幼苗的总RNA, 并检测RNA的完整性。随后按照TaKaRa反转录试剂盒说明书获得cDNA, 荧光定量PCR所用到的引物为qPCR--F: 5¢-GGAGCTCAA TTTCTCGGACTTC-3¢, qPCR--R: 5¢-ATTGAGCG CTTGTTGTTGTTC-3¢。

1.3 ZmMYC2的亚细胞定位分析

以玉米自交系B73黄化苗为材料, 根据Yoo等[29]的方法进行原生质体的转化, 室温避光诱导12～18 h, 在激光共聚焦显微镜观察荧光。

1.4 载体的构建及过表达拟南芥的转化

1.4.1 过表达拟南芥的转化 利用本实验室保存的pMDC43载体, 采用同源重组的方法构建过表达载体。将构建好的pMDC43-35S::重组质粒转化GV3101农杆菌菌株, 采用花药转染法转化过表达拟南芥。

1.4.2 过表达拟南芥阳性苗验证 在过表达载体pMDC43-35S::上含有潮霉素抗性基因, 因此阳性的转基因植株可以在含有潮霉素的MS培养基上正常萌发及生长。将侵染后收到的种子铺在含潮霉素的MS培养基上, 挑选存活的拟南芥幼苗进行种植。2周后提取苗期拟南芥叶片, 使用REB法提取基因组, 以此作为模板, 进行PCR验证, 所用到的引物为Hyg-F: 5¢-CTTCTGC GGGCGATTTGTG-3¢, Hyg-R: 5¢-GGCGAAGAATCTCGT GCTTTC-3¢。

1.5 ZmMYC2拟南芥抗病性分析

1.5.1 突变体、回补材料和过表达材料接种DC3000及叶内菌含量测定 参照前人的方法, 取培养后的DC3000菌液用10 mmol L–1的MgCl2稀释至OD6000.002进行接种拟南芥和叶内菌含量测定[30-31]。

1.5.2 DAB染色和Evans blue染色 取接种DC3000病菌1 d后和7 d后的叶片分别进行DAB染色和Evans blue染色, 具体染色方法参照生工生物工程(上海)股份有限公司试剂盒说明书。

1.6 酵母双杂交试验

采用同源重组法构建pGADT7-JAZ1/3、pGBKT7- MYC2转化载体, 通过在二缺板和四缺板上X-α-gal的颜色观察试验结果。以PGADT7和PGBKT7作为对照, 所用引物为MYC2-BK-F: 5¢-GGAATTCCATATGATGAACC TGTGGACGGACG-3¢, MYC2-BK-R: 5¢-GGAATTCTTA CCTGCCCATGGCAGA-3¢C, JAZ1-AD-F: 5¢-GGAATTCC ATATGATGGCGGCGTCCGCGAGG-3¢, JAZ1-AD-R: 5¢- GGAATTCGCTGAGGTTCAGGCTGGAATCC-3¢, JAZ3- AD-F: 5¢-GGAATTCCATATGATGGCAAAATCTGGTGCC TCCTTT-3¢, JAZ3-AD-R: 5¢-GGAATTCGATCTGTAGTT TTGTACTGGGGGA-3¢。

1.7 病原菌胁迫相关基因表达量分析

取各株系拟南芥接种Pst DC3000前以及接种后24 h的叶片, 使用Trizol法提取RNA, 并检测RNA的完整性。经反转录后获得cDNA, 并以此为模板进行RT-PCR。所用引物为Actin-F: 5¢-CTCCTGAAGAGCACCCTG-3¢, Actin- R: 5¢-CCCTCGTAGATTGGCACA-3¢, qPDF1.2-F: 5¢-ACCT CGCCACAATCACTTCA-3¢, qPDF-1.2-R: 5¢-TACCTGTG GTGACAACGAGC-3¢, qPR1-F: 5¢-CGTGGGTGGACGAG AAGAAG-3¢, qPR1-R: 5¢-GGGCTCGTAGTTGCAGATGA- 3¢, qHIN1-F: 5¢-TCATCTGCAACTACGAGCCC-3¢, qHIN1- R: 5¢-TAACACAAACACACAGCGCG-3¢, qMED25-F: 5¢- AAAAGAAGCTGTGCGCAGTG-3¢, qMED25-R: 5¢-GGG TTGGTACCTGCGGTTTA-3¢, qCOI1-F: 5¢-AAACTGCGT CCAGATCTGCA-3¢¢, qCOI1-R: 5¢-AAGGTCGTGGAGCC ATTCAG-3¢。

2 结果与分析

2.1 玉米转录因子ZmMYC2基因序列及生物信息学分析

从玉米叶中提取RNA, 逆转录获得cDNA, 以cDNA为模板扩增目的基因。基因编码序列全长为2118 bp, 编码705个氨基酸。对其氨基酸序列进行分析, 发现其N端有一个bHLH-MYC_N结构域, 包含一个与JAZ蛋白相互作用的JID结构域和与MED25相互作用的MYC转录激活域TAD; 在其C端含有一个HLH结构域(图1-A)。根据其氨基酸序列, 利用NCBI网站对玉米、水稻、小麦、拟南芥等数据库进行Blast, 得到其同源蛋白序列, 利用MEGA 6.0构建系统进化树。结果显示与拟南芥中的基因高度同源(图1-B)。

2.2 玉米ZmMYC2在不同组织中的表达情况

根据报道的相关转录组数据, 利用TBtools软件对在各个组织中的表达量进行热图分析(图2-A), 结果显示在叶中的表达量最高。分别提取玉米不同组织的总RNA, 逆转录得到cDNA后进行RT-qPCR分析(图2-B), 结果表明在玉米各个组织中都有表达, 但在叶中的表达量最高。

2.3 ZmMYC2的亚细胞定位

基因定位对其功能研究有重要的作用, 为了研究的亚细胞定位, 构建了融合表达载体,作为对照。将这些融合表达载体导入玉米原生质体, 在激光共聚焦显微镜下观察GFP信号。结果显示, ZmMYC2-GFP在细胞核中检测到GFP信号, 同时该荧光信号与细胞核中的红色荧光信号(细胞核共定位marker为红色荧光)重合(图3), 说明ZmMYC2-GFP为细胞核定位蛋白。

A:的蛋白结构域, 采用IBS软件绘制。B: MYC家族系统进化树分析, 采用邻接法利用MEGA 6.0进行绘制。

A: protein domain of, drawing with IBS software. B: phylogenetic tree of MYC family system, drawing with MEGA 6.0 by adjacency method.

图2 ZmMYC2组织特异性表达模式

A:在不同组织中的表达模式。红色、黄色和白色分别表示高、中和低水平的基因表达。B:基因的组织特异性表达模式, R: 根; S: 茎; L: 叶; T: 雄蕊; SK: 花丝; CB: 玉米芯; ST: 苞叶; EM: 胚; EN: 胚乳。

A: the relative expression pattern ofgenes in different tissues. Red, yellow, and white indicate high, medium, and low levels of gene expression, respectively. B: Tissue-specific expression patterns of the ZmMYC2 genes, R: root; S: stem; L: leaf; T: tassel; SK: corn silk; CB: corncob; ST: stegophyll; EM: embryo; EN: endosperm.

图3 ZmMYC2的亚细胞定位

pMDC43-35S-GFP、ZmMYC2-GFP的亚细胞定位, 标尺为20 µm。

Nuclear localization of pMDC43-35S-GFP and ZmMYC2-GFP. Scale bar: 20 µm.

2.4 ZmMYC2在多种激素处理下的表达分析

使用50 μmol L–1的茉莉酸激素处理后,的表达量呈现出先上升后下降的趋势, 在12 h时达到最大值, 约为对照的6.8倍(图4-A), 24 h下调至对照左右; 在水杨酸处理6 h后的表达量达到最大值, 约为对照的4.2倍, 随后下调直至24 h降到最低, 约为对照的0.2倍(图4-B); 乙烯处理3 h后的表达量达到最大值, 约为对照的1.1倍, 随后下调直至24 h降到最低, 约为对照的0.1倍(图4-C)。由此说明响应多种激素的处理, 特别是对茉莉酸激素和水杨酸激素的响应比较明显。

图4 ZmMYC2在多种激素处理下的表达模式

2.5 转ZmMYC2基因拟南芥在植物激素茉莉酸处理下的分析

MYC2参与调控茉莉酸信号路径, 在其他作物中已有报道。为了明确对茉莉酸激素的敏感性, 将转基因种子、突变体种子和回补种子置于1/2 MS培养基上培养4 d, 随后将生长状况基本一致的拟南芥幼苗移到含有50 μmol L–1的茉莉酸激素的MS培养基上继续培养7 d, 对其根长进行测量。结果表明, 过表达拟南芥的根长显著低于野生型; 突变体株系根长明显长于野生型; 回补株系拟南芥相比于野生型无明显差异(图5)。结果说明,可以响应茉莉酸信号途径, 从而抑制根的生长。

2.6 ZmMYC2拟南芥抗病性分析

通过转基因获得了3个表达量较高的过表达株系, 同时利用过表达株系与突变体进行杂交得到2个回补株系。将过表达株系、突变体材料和回补株系材料培养4～5周, 选取健康生长、基本一致的材料进行接种DC 3000, 2 d后进行DAB染色, 5 d后进行Evans blue染色(图6-A, B)。结果显示野生型相对于过表达株系产生较多棕黄色沉淀, 突变体和回补株系相对于野生型产生较多的棕黄色。此外, Evans blue染色结果说明野生型中的活细胞数目多于过表达株系, 突变体和回补株系中的活细胞多于野生型(图6-C, D)。上述结果说明会降低拟南芥对于病原菌侵害的抵御能力。通过对叶片内细菌含量以及死亡面积的统计, 结果显示野生型叶片内细菌含量和叶片死亡面积显著低于过表达株系, 突变体和回补株系叶片内细菌含量和叶片死亡面积都低于野生型(图6-E～J)。这进一步说明能够降低拟南芥对于DC3000侵害的抵御能力。

图5 ZmMYC2过表达、回补和突变体株系对茉莉酸的敏感性

A: 50 μmol L–1的茉莉酸处理7 d的野生型、回补株系、突变体材料和过表达材料图片; B: 茉莉酸处理7 d后的根长统计。误差线表示3个独立试验的标准差, *表示显著性差异(0.01 << 0.05); **表示极显著差异(< 0.01)。

A: wild type, back fed strains, mutant materials, and over-expressed materials treated with 50 μmol L–1JA for 7 days; B: root length after JA treatment for 7 days. Data are means ± SDs. * and ** denote significant differences in WT at the 0.05 and 0.01 probability levels according to Student’s tests, respectively.

A、B:DC3000处理7 d后叶片表型; C、D: DAB和Evans blue染色, E、F、I、J: 叶片病变面积比例, G、H: 叶片内细菌含量。误差线表示3个独立试验的标准差, *表示显著性差异(0.01 << 0.05); **表示极显著差异(< 0.01)。

A, B: leaf phenotype after 7 days of treatment withDC3000; C, D: DAB and Evans blue staining; E, F, I, J: the proportion of lesion area of leaves; G, H: Bacterial content in leaves. Data are means ± SD. * and ** denote significant differences from WT at the 0.05 and 0.01 probability levels according to Student’s tests, respectively.

2.7 茉莉酸激素处理后ZmMYC2对Pst DC3000的抵抗性分析

在接种DC3000前1 d外源喷施50 μmol L–1的茉莉酸激素, 通过DAB染色和Evans blue染色观察过表达株系对于病原菌的抵抗能力(图7-B)。结果显示, 过表达拟南芥产生的H2O2的量较只接种DC3000减少, 发病时间推迟1～2 d, 各个株系的叶片坏死面积均有所减少。同时, 对于叶片坏死面积和叶内菌含量进行统计, 发现叶片坏死面积和叶内菌含量均减少(图7-C, D)。这说明茉莉酸激素能够增强拟南芥对于DC3000的抵抗能力。

2.8 病原菌胁迫相关基因表达量分析

MED25能够调控茉莉酸信号的激活、放大和终止过程, 同时通过jas结构域JAZ蛋白能够与“核受体”COI1互作来调控茉莉酸响应基因的表达[32]。利用基因芯片鉴定出在拟南芥中上调的防御基因[33]。此外,DC 3000能够激活水杨酸途径, 而水杨酸既能抑制茉莉酸的合成, 也能抑制茉莉酸下游信号的转导, PR1是抑制茉莉酸途径所必须的组分。活体营养型病原体能够诱导水杨酸合成, 激活水杨酸信号通路同时抑制茉莉酸信号通路, 这增加了植物对死体营养型病原体的感病性[34]。因此, 本研究选取了、、、和细胞程序性死亡基因来研究茉莉酸激素处理前后DC3000对拟南芥相关基因的表达量进行分析。

图7 茉莉酸和Pst DC3000处理后拟南芥过表达株系表型

A: 喷施JA 1 d后DC3000处理7 d叶片表型; B: DAB和Evans blue染色结果; C, D: 叶片内细菌含量; E: 叶片病变面积比例。误差线表示3个独立试验的标准差, *表示显著性差异(0.01 << 0.05); **表示极显著差异(< 0.01)。

A: after spraying JA 1 d,DC3000 was treated for 7 days for leaf phenotype; B: DAB and Evans blue staining; C, D: bacterial content in leaves; E: the proportion of lesion area of leaves. Data are means ± SD. * and ** denote significant differences in WT at the 0.05 and 0.01 probability levels according to Student’s tests, respectively.

结果显示, 当拟南芥接种DC3000时, 相对于未处理前,的表达量在过表达和野生型拟南芥中病原菌防御基因都是显著上升的(图8-C), 水杨酸信号途径中的表达量在野生型中显著上升, 过表达中的表达量下降(图8-A),和的表达量在野生型和过表达中均显著下降(图8-C,D), 细胞程序性死亡基因HINI的表达量在野生型和过表达中均下降(图8-B); 当使用茉莉酸激素进行处理时,、和在野生型和过表达拟南芥中的表达量相对未处理前均显著下降(图8-A～C),的表达量在野生型中显著下降, 在过表达中显著上升(图8-D),的表达量在野生型中显著上升, 在过表达中基本下降(图8-E); 在接种前喷施茉莉酸激素,的表达量在野生型拟南芥中显著下降, 在过表达中显著上升(图8-C),、、和的表达量在野生型和过表达中均显著下降(图8-A, B, D, E)。

A, B, C, D: 过表达基因表达量分析; F, G, H, I, J: 表示突变体和回补株系表达量分析。误差线表示3个独立试验的标准差, *表示显著性差异(0.01 << 0.05); **表示极显著差异(< 0.01)。

A, B, C, D: the relative overexpression gene; F, G, H, I, J: the relative expression of mutant and backfed lines. Data are means ± SD. * and ** denote significant differences in WT at the 0.05 and 0.01 probability levels according to Student’s tests, respectively.

相对于未处理前, 病原菌防御基因(图8-F)在突变体和回补株系中的表达量均显著上升,、、和的表达量均显著下降(图8-G～J)。

2.9 ZmMYC2与JAZ蛋白的相互作用

转录因子激活下游靶基因的表达通常需要其自身具有转录自激活活性。试验结果表明pGADT7和pGBKT7- ZmMYC2的共转化酵母, 能够在二缺培养基上长出正常菌斑, 在四缺培养基上也能长出正常菌斑, 证实ZmMYC2具备自激活活性(图9-A)。为了消除自激活活性试验影响后续结果, 本试验截取了与JAZ蛋白相互作用的JID区域进行酵母双杂试验。结果表明pGADT7-JAZ1和pGBKT7- ZmMYC2及pGADT7-JAZ3和pGBKT7- ZmMYC2的共转化酵母可以在四缺培养基上正常生长, 说明ZmMYC2可以与JAZ1和JAZ3相互作用。因此, 我们猜测在玉米中ZmMYC2通过与JAZ蛋白相互作用, 参与了茉莉酸信号路径。

图9 ZmMYC2与JAZ蛋白的相互作用

DDO: SD/-Leu-Trp缺陷型培养基, QDO: SD/-Leu-Trp-His-Ade缺陷型培养基。

DDO: synthetic dropout without Leu-Trp, QDO: synthetic dropout without Leu-Trp-His-Ade.

3 讨论

3.1 ZmMYC2具有高度的保守性

MYC转录因子作为茉莉酸信号途径中的重要调控因子, 在动植物中广泛存在。而MYC蛋白具有特有的保守结构域bHLH-MYC_N, 包含1个JAZ相互作用结构域和1个与MED25互作的转录激活结构域。在其C端具有HLH结构域, 能够与E-box或者G-box元件结合[35-36]。本研究通过对玉米、水稻、小麦、拟南芥和短柄草MYC家族转录因子分析, 找到了与拟南芥同源的玉米基因, 结果显示其具有MYC家族特有的结构域。组织表达模式分析,在B73玉米各个组织中均有表达, 但在叶中的表达量最高。通过亚细胞定位, 发现为核定位蛋白。

3.2 ZmMYC2参与调控拟南芥根系的生长

在植物中,基因的表达严重影响着其生长发育。在过表达水稻中,通过介导茉莉酸的合成从而抑制根生长[37]。茉莉酸信号的过度激活会大量消耗植物自身的能量而抑制自身的生长发育进程[38]。而在拟南芥中,通过茉莉酸和ABA在植物代谢途径来抑制拟南芥根系的伸长, 促进侧根的形成[39]。本研究通过对野生型、过表达、突变体和回补材料外源喷施茉莉酸激素, 发现转基因材料相对于野生型根长抑制更明显, 突变体材料根长大于野生型; 回补材料无明显差异。可以响应茉莉酸激素的诱导, 降低拟南芥根的生长。

3.3 ZmMYC2通过参与茉莉酸信号路径来调控拟南芥对Pst DC3000的胁迫

转录因子通过其与功能域DNA及其他蛋白或转录因子间的相互作用, 激活或抑制诱导型基因的表达[40]。研究表明植物bHLH转录因子能够参与调节各种激素信号转导及合成代谢途径[41-42]。在植物的生长发育和生长胁迫中,茉莉酸往往发挥着重要作用[43]。在拟南芥、水稻、番茄等植物中已发现茉莉酸主导的防御途径中MYC2作为主要的调控因子控制着植物应对生长胁迫的能力。在拟南芥中,可以调节多种信号途径, 也可以调节茉莉酸和其他激素的相互作用。同时,能够抑制病原菌防御基因PDF1.2的转录, 可以与MED25亚基相互作用来调节茉莉酸诱导的灰霉病的抗性, 此外, 也可以正调控植物的抗氧化能力[44-45]。本研究通过诱导表达模式分析,可以响应多种激素的诱导, 同时可以与JAZ1和JAZ3蛋白相互作用来调控拟南芥对于病原菌侵害的胁迫。当接种DC3000菌株时,转基因拟南芥相对于野生型发病率更高,降低了拟南芥对于病原菌的胁迫; 而当喷施外源茉莉酸激素时, 转基因拟南芥相对于突变体和回补株系, 增强了对病原菌的胁迫能力。当植物受到外来病原体侵害的时候, 可以直接或者间接诱导茉莉酸的合成, 从而达到激活相关基因来应对病原菌的侵染[46]。据报道, JAZ蛋白是茉莉酸信号的抑制剂, 当植物外源施加茉莉酸激素时, COI1可以与JAZ蛋白相结合, 从而释放出MYC2来增强植物的抗性[47]。MYC2负调节病原菌防御基因的表达[48]。HIN1在水稻中被证明负调控植物的抗病性[49]。在拟南芥中超表达水杨酸代谢酶基因, 会减少植物内源水杨酸含量, 从而导致PR1含量降低, 最终导致植物的抗病性减弱[46]。通过对茉莉酸途径、水杨酸途径、病原菌防御基因和细胞程序性死亡基因的表达量作了相关分析, 进一步说明茉莉酸激素可以增强对DC3000的防御能力。

[1] 陈斌, 韩海亮, 侯俊峰, 包斐, 谭禾平, 王桂跃, 赵福成. 玉米细菌性茎腐病研究进展. 中国植保导刊, 2021, 41(8): 25–29. Chen B, Han H L, Hou J F, Bao F, Tan H P, Wang G Y, Zhao F C. Research progress on bacterial stalk rot of maize., 2021, 41(8): 25–29 (in Chinese with English abstract).

[2] Pel M, Pieterse C. Microbial recognition and evasion of host immunity., 2012, 64: 1237.

[3] Perfect S E, Green J R. Infection structures of biotrophic and hemibiotrophic fungal plant pathogens., 2010, 2: 101–108.

[4] Felix G, Duran J D, Volko S, Boller T. Plants have a sensitive perception system for the most conserved domain of bacterial flagellin., 2010, 18: 265–276.

[5] Kumar M, Karthikeyan N, Prasanna R. Priming of plant defense and plant growth in disease-challenged crops using microbial consortia. In: Choudhary D K, Varma A, eds. Microbial-Mediated Induced Systemic Resistance in Plants. Singapore: Springer Singapore Pte. Limited, 2016. pp 39–56. https://doi.org/10.1007/978- 981-10-0388-2_4.

[6] Pink C. Special Review Issue on plant-microbe interactions: genetics and utilization of pathogen resistance in plants., 1996, 8: 1747–1755.

[7] Dolan L. Origin and diversification of basic-Helix-Loop-Helix proteins in plants., 2010, 27: 862–874.

[8] 谢鹏飞, 朱蕾, 冯玲, 吴进才, 刘景澜. 转录因子MYC2介导植物抗生物胁迫的研究进展. 应用昆虫学报, 2020, 57: 781–787.Xie P F, Zhu L, Feng L, Wu J C, Liu J L. Research progress in transcription factor MYC2 mediating plant resistance to biological stress., 2020, 57: 781–787(in Chinese with English abstract).

[9] Berger S, Bell E, Mullet J E. Two methyl jasmonate-insensitive mutants show altered expression of AtVsp in response to methyl jasmonate and wounding., 1996, 111: 525–531.

[10] 李罡, 李文龙, 许雪梅, 李成浩. MYC2转录因子参与植物发育调控的研究进展. 植物生理学报, 2019, 55: 125–132. Li G, Li W L, Xu X M, Li C H. Research progress of MYC2 transcription factors participating in plant development and regulation., 2019, 55: 125–132 (in Chinese with English abstract).

[11] Browse J. Jasmonate passes muster: a receptor and targets for the defense hormone., 2009, 60: 183–205.

[12] Fernandez-Calvo P, Chini A, Fernandez-Barbero G, Chico J M, Gimenez-Ibanez S, Geerinck J, Eeckhout D, Schweizer F, Godoy M, Franco-Zorrilla J M. ThebHLH transcription factors MYC3 and MYC4 are targets of JAZ repressors and act additively with MYC2 in the activation of jasmonate responses., 2011, 23: 701–715.

[13] Li X, Rui Y, Chen H. TheMediator subunit MED8 regulates plant immunity to Botrytis Cinerea through interacting with the basic helix-loop-helix (bHLH) transcription factor FAMA., 2018, 13: e193458.

[14] Zhang C P, Lei Y T, Lu C K, Wang L, Wu J Q. MYC2, MYC3, and MYC4 function additively in wounding-induced jasmonic acid biosynthesis and catabolism., 2020, 62: 1159–1175.

[15] Kazan K, Manners J M. MYC2: the master in action., 2013, 6: 686–703.

[16] Uji Y, Taniguchi S, Tamaoki D, Shishido H, Akimitsu K, Gomi K. Over-expression of OsMYC2 Results in the up-regulation of Early JA-rresponsive genes and bacterial blight resistance in rice., 2016, 57: 1814–1827.

[17] Hiruma K, Nishiuchi T, Kato T, Bednarek P, Okuno T, Schulze-Lefert P, Takano Y.ENHANCED DISEASE RESISTANCE 1 is required for pathogen-induced expression of plant defensins in nonhost resistance, and acts through interference of MYC2-mediated repressor function., 2011, 67: 980–992.

[18] Jeong J S, Jung C, Seo J S, Kim J K, Chua N H. The deubiquitinating enzymes UBP12 and UBP13 positively regulate MYC2 levels in jasmonate responses., 2017, 29: 1406–1424.

[19] Lorenzo O. JASMONATE-INSENSITIVE1 encodes a MYC transcription factor essential to discriminate between different jasmonate regulated defense responses in., 2004, 16: 1938–1950.

[20] Wasternack C, Hause B. Jasmonates: biosynthesis, perception, signal transduction and action in plant stress response, growth and development., 2013, 111: 1021–1058.

[21] Evik V, Kidd B N, Zhang P, Hill C, Kiddle S, Denby K J, Holub E B, Cahill D M, Manners J M, Schenk P M. MEDIATOR25 acts as an integrative hub for the regulation of jasmonate-responsive gene expression in., 2012, 160: 541–555.

[22] Nosil P, Crespi B J, Sandoval C P. Host-plant adaptation drives the parallel evolution of reproductive isolation., 2002, 417: 440–443.

[23] 悦曼芳, 张春, 郑登俞, 邹华文, 吴忠义. 玉米转录因子ZmbHLH91对非生物逆境胁迫的应答. 作物学报, 2022, 48: 3004–3017. Yue M F, Zhang C, Zheng D Y, Zou H W, Wu Z Y. Response of maize transcriptional factorto abiotic stress., 2022, 48: 3004–3017 (in Chinese with English abstract).

[24] 吕迪, 陈茹梅, 周晓今. ZmJAZ与ZmMYC2的BiFC互作研究. 生物技术通报, 2022, 38(1): 77–85. Lyu D, Chen R M, Zhou X J. Interactions between ZmJAZ and ZmMYC2 using bimolecular fluorescence complementation assay., 2022, 38(1): 77−85 (in Chinese with English abstract).

[25] Fu J, Liu L, Liu Q, Shen Q, Wang C, Yang P, Zhu C, Wang Q. ZmMYC2 exhibits diverse functions and enhances JA signaling in transgenic., 2020, 39: 273–288.

[26] Fu J, Wang L, Pei W, Yan J, He L, Ma B, Wang C, Zhu C, Chen G, Shen Q, Wang Q. ZmEREB92 interacts with ZmMYC2 to activate maize terpenoid phytoalexin biosynthesis upon fusarium graminearum infection through jasmonic acid/ethylene signaling., 2023, 237: 1302–1319.

[27] Ma C, Li R, Sun Y, Zhang M, Li S, Xu Y, Song J, Li J, Qi J, Wang L, Wu J. ZmMYC2s play important roles in maize responses to simulated herbivory and jasmonate.,2023, 65:1041–1058.

[28] Fu J, Liu L, Liu Q, Shen Q, Wang C, Yang P, Zhu C, Wang Q. ZmMYC2 exhibits diverse functions and enhances JA signaling in transgenic., 2020, 39: 273–288.

[29] Yoo S D, Cho Y H, Sheen J.mesophyll protoplasts: aversatile cell system for transient gene expression analysis., 2007, 2: 1565–1572.

[30] 李泽. 转录因子ERF114介导PevD1诱导拟南芥对Pst DC3000的抗性及分子机制. 中国农业科学院硕士学位论文, 北京, 2021. Li Z. The Transcription Factor ERF114 Mediates PevD1-Inducedresistance to Pst DC3000 and Molecular Mechanism. MS Thesis of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing, China, 2021 (in Chinese with English abstract).

[31] Fernández-Calvo P, Chini A, Fernández-Barbero G, Chico J, Gimenez-Ibanez S, Geerinck J, Eeckhout D, Schweizer F, Godoy M, Franco-Zorrilla J M, Pauwels L, Witters E, Puga M I, Paz-Ares J, Goossens A, Reymond P, De Jaeger G, Solano R. ThebHLH transcription factors MYC3 and MYC4 are targets of JAZ repressors and act additively with MYC2 in the activation of jasmonate responses., 2011, 23: 701–715.

[32] Zhai Q Z, Deng L, Li C Y. Mediator subunit MED25: at the nexus of jasmonate signaling., 2020, 57: 78–86.

[33] Devoto A, Ellis C, Magusin A, Chang H, Chilcott C, Zhu T, Turner J G. Expression profiling reveals COI1 to be a key regulator of genes involved in wound- and methyl jasmonate-induced secondary metabolism, defence, and hormone interactions., 2005, 58: 497–513.

[34] Spoel S H, Johnson J S, Dong X. Regulation of tradeoffs between plant defenses against pathogens with different lifestyles, 2007, 104: 18842–18847.

[35] Dolan L. Origin and diversification of basic-helix-loop-helix proteins in plants., 2010, 27: 862–874.

[36] Wang H, Ding C, Du H, Liu H, Wang Y, Yu D. Identification of soybean MYC2-like transcription factors and overexpression of GmMYC1 could stimulate defense mechanism against common cutworm in transgenic tobacco., 2014, 36: 1881–1892.

[37] Uji Y, Taniguchi S, Tamaoki D, Shishido H, Akimitsu K, Gomi K. Over-expression of OsMYC2 results in the up-regulation of early JA responsive genes and bacterial blight resistance in rice., 2016, 57: 1814–1827.

[38] Wu F M, Deng L, Zhai Q Z, Zhao J H, Chen Q, Li C Y. Mediator Subunit MED25 Couples alternative splicing ofgenes with fine-tuning of jasmonate signaling., 2020, 32: 429–448.

[39] Prasad B R V, Kumar S V, Nandi A, Chattopadhyay S. Functional interconnections of HY1 with MYC2 and HY5 inseedling development., 2012, 12: 37.

[40] 吴忠义, 杨梦婷, 张春, 王作平, 邹华文. 玉米基因的克隆及功能研究. 作物学报, 2020, 46: 2008–2016. Wu Z Y, Yang M T, Zhang C, Wang Z P, Zou H W. Cloning and functional analysis ofgene in maize., 2020, 46: 2008–2016(in Chinese with English abstract).

[41] Qi T, Huang H, Wu D, Yan J, Qi Y, Song S, Xie D.DELLA and JAZ proteins bind the WD-repeat/bHLH/MYB complex to modulate gibberellin and jasmonate signaling synergy, 2014, 26: 1118–1133.

[42] Nakata M, Mitsuda N, Herde M, Koo A, Moreno J E, Suzuki K, Howe G A, Ohme-Takagi M. A bHLH-type transcription factor, ABA-INDUCIBLE BHLH-TYPE TRANSCRIPTION FACTOR/ JA-ASSOCIATED MYC2-LIKE1, acts as a repressor to negatively regulate jasmonate signaling in., 2013, 25: 1641–1656.

[43] 冉燕子. 苗期低温胁迫对烟草JA信号途径部分关键基因表达及JA含量的影响. 西南大学硕士学位论文, 重庆, 2017. Ran Y Z. Effects of Low Temperature Stress on Expression of Part Key Gene in JA Signaling Pathway and JA Content of Tobacco at Seeding Stage. MS Thesis of Southwest University, Chongqing, China, 2017 (in Chinese with English abstract).

[44] Zhang F, Zhang J G, Wang L H, Mao D X. Effects of polygonatum sibiricum polysaccharide on learning and memory in a scopolamine-induced mouse model of dementia.,2008, 3: 33–36.

[45] Anderson J P, Badruzsaufari E, Schenk P M, Manners J M, Desmond O J. Antagonistic interaction between abscisic acid and jasmonate-ethylene signaling pathways modulates defense gene expression and disease resistance in, 2004, 16: 3460–3479.

[46] 何翔. 茉莉酸和水杨酸通过EIN 3和ORA 59相互作用调控PDF 1.2的表达量. 四川农业大学博士学位论文, 四川成都, 2017. He X. Ora59 and Ein3 Interaction Couples Jasmonate Ethylene Synergistic Action to Antagonistic Salicylic Acid Regulation of PDF1.2 Expression. PhD Dissertation of Sichuan Agricultural University, Chengdu, Sichuan, China, 2017 (in Chinese with English abstract).

[47] Chini A, Boter M, Solano R. Plant oxylipins: COI1/JAZs/MYC2 as the core jasmonic acid-signalling module., 2010, 276: 4682–4692.

[48] Dombrecht B, Xue G P, Sprague S J, Kirkegaard J A, Ross J J, Reid J B, Fitt G P, Sewelam N, Schenk P M, Manners J M, Kazan K. MYC2 differentially modulates diverse jasmonate-dependent functions in, 2007, 19: 2225–2245.

[49] 于玉凤. OsHIN1负调控水稻抗白叶枯病的机理初探. 浙江师范大学硕士学位论文, 浙江金华, 2020. Yu Y F. A Preliminary Study on the Mechanism of OsHIN1 Negatively Regulates Rice Resistance against Bacterial Blight. MS Thesis of Committee of Zhejiang Normal University, Jinhua, Zhejiang, China, 2020 (in Chinese with English abstract).

Cloning and functional analysis of maizegene

DU Ming1, CHEN Ming-Chao3, FANG Yu1,2, and WU Jian-Dong3,*

1Shanghai ZKW Molecular Breeding Technology Co., Ltd, Shanghai 200030, China;2Anhui Win-all Hi-tech Seed Co., Ltd., Hefei 230088, Anhui, China;3Anhui Agricultural University / National Engineering Laboratory of Crop Stress Resistance, Heifei 230036, Anhui, China

Plants are often harmed by pathogens during their growth and development, which seriously affect crop yield. MYC2 belongs to the bHLH family of transcription factors and plays an important role in the regulation of JA-mediated signaling pathways. In the previous work, maize genewhich was homologous towasdetected through the analysis of the MYC family evolutionary tree. In this study, we cloned, which had a total length of 2118 bp and encoded 705 amino acid residues. The encoded protein was localized in the nucleus. RT-qPCR analysis showed thatwas expressed in all tissues of maize, but the relative expression level was the highest in leaves. The results showed thatcould be induced by jasmonic acid (jasmonic acid, JA), salicylic acid (salicylic acid, SA), and ethylene (ethylene, ETH). In 50 μmol L–1JA medium, root length of overexpressedwas significantly shorter than wild type, and that of mutantwas significantly longer than wild type. There was no significant difference in root length betweenand wild type.DC3000 (Psedumonas syrinage pv.tomato DC3000,DC3000) was inoculated withmaterials, and the wild type, mutant, and complementshowed better state relative to over expression. It was speculated thatdecreased the defense ability ofagainst pathogen. Before inoculation, the dead area of leaves and the amount of bacteria in leaves with the overexpression ofwere reduced by exogenous JA hormone. JA hormone enhanced the resistance ofto pathogens. Subcellular localization showed that ZmMYC2 was a nuclear localization protein. The yeast two-hybrid showed that ZmMYC2 could interact with JAZ1 and JAZ3 in JAZ protein. The relative expression levels of JA, SA, defense genes, and programmed cell death genes showed thatnegatively regulated the relative expression level of PDF1.2, and positively regulated the relative expression level of PR1, MED25, COI1, and programmed cell death gene. In conclusion, ZmMYC2 was involved in JA signal transduction by interacting with JAZ1 and JAZ3, which reduced the defense ability ofagainst pathogen stress.

maize;; pathogen defense; jasmonic acid

2023-07-03;

2023-07-13.

10.3724/SP.J.1006.2023.23081

通信作者(Corresponding author): 武健东, E-mail: wujiandong@ahau.edu.cn

E-mail: dm@zkwbreeding.com

2022-12-21;

本研究由荃银高科国家企业技术中心创新项目(2021M002), 安徽省自然科学基金项目(2008085MC70)和安徽省高等学校自然科学研究项目(KJ2021A0172)资助。

This study was supported by the National Enterprise Technology Center Innovation Project of Anhui Win-all Hi-tech Seed Co., Ltd (2021M002), the Anhui Provincial Natural Science Foundation (2008085MC70), and the Anhui Provincial Key Research and Development Project (KJ2021A0172).

URL: https://kns.cnki.net/kcms2/detail/11.1809.S.20230713.1025.004.html

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