多肽配体R18促进水稻弱势籽粒灌浆的初步研究

张志兴 陈 花 敏秀梅 许海龙 宋 果 林文雄,*

多肽配体R18促进水稻弱势籽粒灌浆的初步研究

张志兴1,2陈 花1敏秀梅1许海龙1宋 果1林文雄1,2,*

1福建农林大学生命科学学院, 福建福州, 350002;2福建农林大学 / 福建省农业生态过程与安全监控重点实验室, 福建福州, 350002

14-3-3蛋白在植物生长发育中具有重要的调控作用, 其亚型GF14f在水稻弱势籽粒中高表达是其灌浆结实差的一个重要的原因。本研究首先通过分子对接的方式, 发现多肽R18与GF14f蛋白具有潜在的结合位点, 进而采用体外竞争性实验, 发现R18能够竞争性的与GF14f蛋白结合, 从而导致GF14f与SuS2、SS和AGPS三个互作靶蛋白间的结合力减弱, 与此同时, 体外酶活实验表明, 外源添加R18能够显著提高淀粉合成酶(StSase)、蔗糖合成酶(SuSase)和ADPG焦磷酸化酶(AGPase) 3个酶的活性。免疫共沉淀实验表明, R18在水稻籽粒中除了能和GF14f结合外, 还能与GF14b、GF14c、GF14d及GF14e结合, BiFC结果也证实了上述结果。籽粒灌浆期, 外源喷施60 mg L–1浓度的R18于弱势籽粒上, StSase、SuSase及AGPase酶活性显著提高, 弱势籽粒千粒重及结实率也显著提高。本研究结果表明, 多肽配体R18能够与14-3-3互作靶蛋白竞争性结合, 减弱14-3-3与靶蛋白间的结合力, 进而释放籽粒灌浆过程中蔗糖转化及淀粉合成途径中关键酶的活性, 从而有利于弱势籽粒灌浆充实。

水稻; 弱势籽粒; 灌浆; 14-3-3蛋白; 多肽配体

强弱势籽粒灌浆差异现象已成为水稻科学和生产上长期未解决的难题[1], 特别是近些年来选育的水稻大穗型品种, 虽然其增产潜力大, 但弱势籽粒灌浆差的问题更为突出[2]。杨建昌等[2]通过对12个超级水稻品种的观察, 发现弱势粒的结实率和千粒重分别比强势粒低20.7%和7.2 g, 而3个普通高产品种弱势粒的结实率和千粒重分别比强势粒低6.3%和3.0 g, 可见, 若能有效的促进弱势籽粒的灌浆, 对激发水稻高产的潜力贡献巨大。近些年来, 随着各种高通量遗传信息分析方法及分子生物学技术的发展, 为进一步揭示水稻强弱势籽粒灌浆差异提供了可能。Zhu等[3]、Sekhar等[4]和Sun等[5]所在的团队分别采用DNA芯片、SSH和RNA-seq技术, 比较分析了强弱势籽粒之间的基因表达差异, 鉴定到大量与弱势籽粒灌浆差相关的基因。You等[6]发现移除穗顶端的强势籽粒后, 底端的弱势籽粒的大小、千粒重及结实率显著得到提高, 并进一步通过差异蛋白组学的技术分析了弱势籽粒灌浆促进的机制, 从中发现移除顶端强势籽粒后的弱势籽粒中14-3-3蛋白的表达量显著下降。笔者通过对构建的胚乳特异性转基因水稻的研究发现, 在灌浆期特异减少胚乳中14-3-3蛋白亚型GF14f的表达, 能显著促进弱势籽粒灌浆[7]。由此可见, 弱势籽粒中14-3-3蛋白的表达量较高是导致其灌浆相对强势籽粒差的一个重要的原因。因此, 如何充分利用这些已发现的灌浆关键(基因)蛋白, 达到改良弱势籽粒灌浆的目的, 是下一步强弱势籽粒灌浆研究的难点和重点。

众所周知, 生物体通过复杂的蛋白–蛋白相互作用从而实现对生理过程中的多种生物功能, 如信号传导、新陈代谢、抗逆响应、细胞生长及细胞增殖等调控[8], 因此, 若能靶向扰动生物体内蛋白-蛋白的相互作用关系, 便可以实现对相关生理活动的人为调控。已有研究表明, 植物中的大部分14-3-3蛋白作为调控因子, 通过蛋白互作调控其靶蛋白的活性, 在植株生长发育及其响应逆境胁迫的过程中发挥着重要的功能[9-10]。拟南芥中的研究表明, 14-3-3蛋白能够负调节植株的耐盐性, 正常条件下, 14-3-3蛋白能够与Ser-294位点磷酸化后的SOS2激酶结合, 进而抑制SOS2激酶的活性, 而在盐胁迫下, 14-3-3蛋白与SOS2激酶的结合力减弱, 释放了SOS2激酶活性, 激发了与抗盐相关的SOS1 Na+/H+反向转运活性, 因此, 拟南芥14-3-3蛋白突变体材料与野生型相比表现出显著的耐盐表型[11]。笔者前期的研究表明, 14-3-3蛋白亚型GF14f能够与籽粒灌浆过程中的SS、SUS2和AGPS蛋白结合, 从而抑制StSase、SuSase和AGPase的酶活性, 而特异性减少GF14f蛋白的表达, 却能够释放上述3个酶的活性[7]。据此, 笔者猜想若能够在蛋白互作层面, 靶向改变14-3-3蛋白与其互作靶蛋白间的关系, 或许能够实现对14-3-3蛋白功能的人为调节。

近年来, 随着生物技术的不断发展, 多肽配体(peptide aptamers, PA, 又名肽适体)等人造小分子已成为直接影响蛋白质功能的有效技术[12-13]。多肽配体是在惰性支架蛋白中展示肽环的短肽(8~20个氨基酸), 对给定靶蛋白具有高度特异性结合亲和力, 并失活目标蛋白质, 因此, 作为强竞争性抑制剂, 能特异性地阻断蛋白质-蛋白质相互作用的形成, 在不改变蛋白质水平或结构的情况下干扰基因功能[12]。针对14-3-3蛋白的多肽配体筛选, 最早是在哺乳动物细胞中开展的。Wang等[14]采用噬菌体展示随机肽文库技术筛选到14-3-3蛋白的高亲和力多肽配体R18, 进一步发现R18作为14-3-3的配体, 能有效阻断14-3-3与生理学激酶Raf-1的结合, 并有效抑制14-3-3蛋白与磷酸化的Bad和ASK1 (凋亡信号调节激酶1)以及未磷酸化的外酶S之间的相互作用, 起到类似干扰的效果。但目前针对植物14-3-3蛋白的靶向多肽配体的筛选未见报道。基于14-3-3蛋白在真核生物中的高度保守性, 笔者推测多肽配体R18或许能够与水稻籽粒14-3-3蛋白特异性结合, 起到干扰14-3-3蛋白与其互作靶蛋白的作用, 进而达到调控弱势籽粒灌浆的目的, 但具体机制还需进一步的研究。

1 材料与方法

1.1 材料与处理方法

本研究所采用的供试材料为, 大穗型水稻品种‘金恢809’, 种植于福建农林大学(福建省福州市)的校内农场, 3月15日播种, 采用旱育方式育秧, 4月15日移栽至大田, 每个处理各在田间种植3个小区, 每个小区9 m2, 栽插密度为20 cm´20 cm, 单本栽插。在水稻抽穗开花初期, 在每个小区各选择生长整齐一致、同日抽穗开花的主穗, 挂牌标记, 连续挂牌3 d。选取同一天挂牌的稻穗, 花后7 d, 开始对稻穗的弱势籽粒(穗的下半部)进行涂抹处理, 处理分为实验组和对照组, 实验组: 用毛刷涂抹60 mg L–1R18溶液(含0.01% 吐温-20, v/v), 每穗约1 mL; 对照组: 用毛刷涂抹水溶液(含0.01%吐温-20, v/v), 每穗约1 mL; 每隔2 d刷一次, 共3次。在籽粒灌浆的前期(花后10 d)、中期(花后20 d)和后期(花后30 d) 3个时期, 选取挂牌标记的弱势籽粒, 液氮速冻后保存于-80℃超低温冰箱中, 作为后期实验样品。强弱势籽粒划分参照Ishimaru等[15]的方法。成熟期选取挂牌标记的稻穗, 晒干后用于籽粒千粒重及结实率的测定。

1.2 分子虚拟对接分析

从NCBI上(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载14-3-3蛋白亚型GF14f的氨基酸序列, 并采用protein BLAST工具对目标序列进行比对, 搜索同源性和得分较好的蛋白质晶体结构作为建模的模板, 并从Protein Data Bank中下载对应的晶体结构, 在Modeller 9.18环境下进行手动建模, 获得GF14f空间结构模型。通过已有文献获得R18氨基酸序列(PHCVPRDLSWLDLEANMCLPP)[9], 之后采用Protein-peptide分子对接程序CABS-dock (http:// biocomp.chem.uw.edu.pl/CABSdock/)进行GF14f蛋白与R18多肽docking, Pymol软件用于分子对接结果分析。

1.3 R18多肽合成及多克隆抗体制备

依据R18多肽的氨基酸序列(PHCVPR­DLSWLDLEANMCLPP), 合成纯度>95%的R18多肽粉末, 依据R18碱基序列(5'-CCCCACTGCGT­GCCCAGGGACCTGAGCTGGCTGGACCTGGAGGCCAACATGTGCCTGCCCCCC-3')合成R18碱基全长序列, 之后运用SnapGene veiwer软件选择载体酶切位点:RI、I, 构建pet32a_His_R18融合表达载体, 所用引物序列见表1。IPTG诱导表达后, 采用镍柱(Ni Sepharose 6 Fast Flow, 瑞典)纯化His_R18融合表达蛋白, SDS-PAGE检测后, 进行兔子免疫, 4次注射后, 取血清, 亲和纯化并检测, 获得R18多克隆抗体。

1.4 蛋白体外结合实验(Pull-down)

笔者前期的研究已证实GF14f蛋白能与starch synthase (SS)、sucrose synthase 2 (SUS 2)和glucose-1-phosphate adenylyltransferase small subunit (AGPS)这3个亚基蛋白存在直接的互作关系[7], 故本研究选取上述3个互作靶蛋白进行GF14f及R18之间的体外竞争性结合实验分析。GST标签的融合蛋白表达载体pGEX-6P-1_GST_GF14f, His标签的融合蛋白表达载体pet32a_His_AGPS, pet32a_His_SS, pet32a_His_SUS2均为实验室前期构建。参考Zhang等[7]的方法, 进行GST融合蛋白及His融合蛋白的纯化。将纯化好的GST标签蛋白用pull-down结合缓冲液孵育后, 加入纯化后的His标签蛋白, 洗脱后, 利用商业化的His (Abmart, 中国上海)及GST (Abmart, 中国上海)抗体进行Western-Blot检测。

1.5 免疫共沉淀

选用外源涂抹R18的实验组和清水的对照组弱势籽粒(花后20 d)各1 g, 参照Zhang等[16]的方法, 进行籽粒非变性蛋白提取。分别在实验组及对照组的籽粒非变性蛋白中加入体积比0.5%的预洗protein G Agarose (PGS), 4℃孵育1 h后, 离心取上清, 加入体积比1%的R18多克隆抗体, 4℃孵育过夜, PBS缓冲液洗沉淀后, SDS-PAGE电泳检测。所选蛋白条带采用胰蛋白酶酶解后, 采用反相液质联用RPLC-MS对蛋白样品进行鉴定。液相色谱仪采用EASY-nLC 1000 (Thermo Scientific, 美国), 质谱数据的采集使用Thermo Orbitrap Fusion质谱仪(Thermo Scientific, 美国)。质谱产生的raw文件通过MaxQuant version 1.6.5 (http://www.maxquant.org/)进行搜库, 以RGAP (http://rice.plantbiology.msu.edu/)下载的水稻蛋白序列为检索比对数据库。

1.6 BiFC实验

分别构建YFPN-GF14b、YFPN-GF14f和YFPC-R18的BiFC载体, 引物序列见表1, 测序正确后分别转化农杆菌EHA105中, 加入到含有卡纳霉素和利福平的的YEB液体培养基中, 28℃恒温摇床培养1~2 d后, 菌液PCR验证; 之后转接至LB培养基中至菌液OD值达到1.0后, 使用注射缓冲液(10 mmol L–1MES, 150 μmol L–1AS, 10 mmol L–1MgCl2)悬浮菌体, 1︰1注射到五叶期烟草叶片中, 使用激光共聚焦显微镜(Leica TCS SP8, 德国)观察渗透1~2 d后的荧光发光情况。

1.7 酶活测定

称取去除颖壳的籽粒样品1 g, 加入5 mL预冷的酶活提取液(含100 mmol L–1Tricine-NaOH, pH 7.5, 8 mmol L–1MgCl2, 2 mmol L–1EDTA, 12.5% (v/v) Glycerol; 1% (w/v) PV P-40, 50 mmol L–12-mercap-toethanol), 置于预冷研钵中冰浴快速研磨, 4℃ 10,000转min–1离心10 min, 取上清液为粗酶液备用。StSase、SuSase和AGPase酶活测定参照酶活测定试剂盒说明书(苏州科铭生物技术有限公司, www.cominbio.com)进行。

1.8 试验数据处理

采用Microsoft Excel 2007整理数据和制作图表, DPS V7.05软件统计分析, 以LSD (<0.05)检验平均数间的差异显著性。

表1 引物序列及用途

2 结果与分析

2.1 GF14f蛋白与R18分子对接

采用CABS-dock程序对GF14f蛋白与多肽配体R18进行分子柔性对接, 结果如图1所示, R18经对接后位于GF14f蛋白空间结构结合口袋中, 配体与蛋白具有较好的匹配度(图1-A), 配体R18与GF14f蛋白互作氢键分析表明, 多肽配体R18与GF14f蛋白中残基R59 、R63、 N53、 E15 、N45、 D218 以及K217形成7个氢键(图1-B), 说明R18多肽与GF14f蛋白有较高的亲和力和结合稳定性, 作为GF14f蛋白靶点抑制剂具有较好的潜力。

2.2 体外竞争性实验验证R18对14-3-3互作蛋白的影响

分别纯化GST-GF14f、His-R18、His-SUS2、His-AGPs及His-SS的融合表达蛋白, 之后进行体外pull-down实验。为探究R18干扰GF14f与其互作蛋白结合的临界值, 本研究先以His-SUS2为例进行浓度梯度实验, 结果如图2-A所示, 在GST-GF14f和His-SUS2蛋白添加量一致的条件下, 随着His-R18浓度的增加, His-SUS2的条带逐渐变浅, R18的条带逐渐加深, 当His-R18的添加量达到60 mg L–1时, His-SUS2的条带完全消失, 证明R18完全干扰GF14f与其互作蛋白结合的临界值为60 mg L–1(图2-A), 基于此, 以临界值60 mg L–1的His-R18添加量进一步验证GST-GF14f与His-SS及His-AGPS蛋白的结合度, 图2-B和C表明在His-R18浓度为60 mg L–1的条件下, 与阳性对照(未添加R18蛋白)对比, 用His抗体未检测到His-AGPS和His-SS的条带, 但能检测到His-R18的条带, 再一次证明R18能使GF14f与其互作蛋白的结合度降低, 甚至完全取代其互作蛋白与GF14f蛋白结合, 起到干扰GF14f蛋白功能的作用。

A: 随着His-R18浓度的增加GST-GF14f与His-SUS2之间的结合力逐渐减弱; B: 60 mg L–1His-R18作用下GF14f与AGPS间的结合力显著下降; C: 60 mg L–1His-R18作用下GF14f与SS间的结合力显著下降。

A: theinteraction between GST-GF14f and His-SUS2 is gradually weakened with an increase in the concentration of His-R18; B: theinteraction between GST-GF14f and His-AGPS is weakened at 60 mg L–1of His-R18; C: theinteraction between GST-GF14f and His-SS is weakened at 60 mg L–1of His-R18.

2.3 体外竞争性实验验证R18对淀粉合成过程关键酶活性的作用

通过体外酶活实验, 验证R18对淀粉合成过程中相关酶活的调控效应, 首先选用SuSase, 进行浓度梯度分析。将籽粒粗酶液等分为6管, 同时加入10 μL磷酸酶抑制剂复合物, 10 μL ATP溶液, 之后其中一管不加任何试剂作为空白对照, 剩余5管依次加入不同剂量的R18多肽, 使提取液中R18的最终浓度分别为0、1、6、12和60 mg L–1, 结果如图3-A所示, 与空白对照相比, 随着R18浓度的升高, SuSase活性逐渐升高, 且在R18浓度达到60 mg L–1时, 活性最高。在此基础上, 进一步体外分析了60 mg L–1的R18对StSase及AGPase的酶活性的影响, 结果如图3-B和C所示, 60 mg L–1的R18的添加浓度能够显著提高上述2个酶的活性。

A: 随着R18浓度的增加蔗糖合成酶的活性逐渐提高。B: 60 mg L–1R18作用下ADPG焦磷酸化酶活性显著提高。C: 60 mg L–1R18作用下淀粉合成酶活性显著提高。

A: the enzyme activity of SuSase is gradually increased with an increase in the concentration of R18. B: the enzyme activity of AGPase is significantly increase at R18 concentrations of 60 mg L–1. C: the enzyme activity of StSase is significantly increase at R18 concentrations of 60 mg L–1.

2.4 免疫共沉淀分析R18与14-3-3蛋白家族间的互作

为了验证R18与水稻籽粒内14-3-3蛋白不同亚型间的互作关系, 本研究选取外源涂抹R18实验组的弱势籽粒, 以涂抹清水的弱势籽粒样品为对照, 采用免疫共沉淀技术分析R18与弱势籽粒中14-3-3蛋白的结合情况。为判断外源涂抹R18进入水稻籽粒的情况, 选取灌浆中期(花后20 d)及后期(花后30 d)水稻弱势籽粒, 去除颖壳后, 提取天然蛋白, 采用R18抗体进行Western blot验证(图4), 表明用R18抗体检测实验组弱势籽粒在花后20 d和30 d中均有目的条带, 而在对照组中未检测到目的条带, 证明外源涂抹R18确实能从颖壳进入到籽粒的子房中, 且在灌浆中后期均存在于籽粒中。之后, 分别提取R18和清水涂抹后的花后20 d弱势籽粒的非变性蛋白, 加入体积比0.5%的预洗PGS, 及体积比1%的R18多克隆抗体, 4℃孵育过夜, PBS缓冲液洗脱后, SDS-PAGE电泳检测, 切胶, 胰蛋白酶酶解后, 采用LC-MS进行质谱鉴定。蛋白质谱数据库检索后, 将R18处理组与清水对照组的结果进行比较分析, 筛选与R18结合的14-3-3蛋白亚型, 结果如表2所示, 共在水稻籽粒中鉴定到5个14-3-3蛋白亚型与R18存在互作, 分别为GF14b、GF14c、GF14d、GF14e和GF14f。

2.5 双分子荧光互作实验验证R18与14-3-3蛋白在植物细胞内的相互作用

为了进一步从植物细胞内验证R18与水稻14-3-3蛋白亚型间的相互作用关系, 选取14-3-3蛋白2个亚型GF14b和GF14f, 进行BiFC实验。分别构建了YFPN-GF14b、YFPC-R18及YFPN-GF14f表达重组载体。将构建好的载体以及空载体共同瞬时转化烟草叶肉细胞, 避光培养48 h后, 在515 nm黄色激发光、100×物镜下激光共聚焦显微镜下观察黄色荧光信号, 同时设置YFPN-GF14b-YFPC、YFPN-GF14f-YFPC、YFPC-R18-YFPN为阴性对照。结果(图5)显示, 在激光共聚焦显微镜下, YFPC-R18和YFPN-GF14b、YFPN-GF14f的烟草均检测到黄色荧光信号, 而阴性对照不发光, 说明R18与GF14b和GF14f在植物细胞内存在互作关系。

DAF: 开花后天数; CBB: 考马斯亮蓝。DAF: days after flowering; CBB: coomassie brilliant blue.

表2 R18与水稻籽粒14-3-3蛋白亚型互作列表

A: R18与GF14b相互作用; B: R18与GF14f相互作用。

A: the interaction between R18 with GF14b; B: the interaction between R18 with GF14f.

2.6 籽粒灌浆期外源涂抹处理验证R18对弱势籽粒灌浆的影响

通过外源涂抹的方法, 验证籽粒灌浆期外源导入R18对弱势籽粒灌浆的影响。60 mg L–1的R18溶液涂抹后, 选取灌浆前(花后10 d)、中(花后20 d)和后(花后30 d) 3个时期实验组与对照组弱势籽粒, 分别测定SuSase、StSase及AGPase的酶活性。由图6可以看出,籽粒灌浆期外源涂抹R18后, 弱势籽粒中上述3个淀粉合成关键酶的活性在整个灌浆时期均显著高于对照组。之后, 在水稻成熟期选取实验组与对照组的弱势籽粒, 比较两者千粒重与结实率的变化情况, 结果如图7所示, 涂抹R18后, 弱势籽粒的千粒重和结实率都高于涂抹水的对照组, 且有显著差异, 这进一步证明R18对水稻弱势籽粒灌浆有促进作用。

A: 60 mg L–1R18溶液作用下ADPG焦磷酸化酶活性显著提高; B: 60 mg L–1R18溶液作用下蔗糖合成酶活性显著提高; C: 60 mg L–1R18溶液作用下淀粉合成酶活性显著提高。不同小写字母表示< 0.05差异显著。

A: the enzyme activity of AGPase is significantly increase with the 60 mg L–1R18 solution; B: the enzyme activity of SuSase is significantly increase with the 60 mg L–1R18 solution; C: the enzyme activity of StSase is significantly increase with the 60 mg L–1R18 solution. Different lowercase letters indicate significant difference at< 0.05 among the treatments.

A: 弱势籽粒千粒重变化; B: 弱势籽粒结实率变化。不同小写字母表示< 0.05差异显著。

A: the change in the 1000-grain weight of rice inferior spikelets; B: the change in the seed setting rate of rice inferior spikelets. Different lowercase letters indicate significant difference at< 0.05 among the treatments.

3 讨论

14-3-3蛋白家族在真核生物中是个高度保守的酸性蛋白家族。在人体细胞中14-3-3蛋白共有7个亚型, 涉及癌症[17-18]和神经系统[19]等多种疾病。因此, 14-3-3蛋白在医学上已成为一个重要的潜在药物治疗靶点。通过噬菌体技术筛选获得的14-3-3蛋白靶向多肽R18, 能模拟对接磷酸化的14-3-3配体蛋白, 并与14-3-3互作蛋白竞争相同的结合位点, 从而发挥抑制效应[9]。例如, 由2个R18序列组装的特异抑制剂Difopein, 能够竞争性的抑制肿瘤细胞中14-3-3蛋白与Bad的结合, 将Bad释放出来, 使之与Bcl2结合, 从而诱导细胞凋亡[20]。本研究在水稻中也发现R18能够与籽粒中14-3-3蛋白亚型GF14f结合, 从而导致GF14f与其互作靶蛋白间的结合力减弱。此外, 本研究还发现R18除了能够与籽粒胚乳中GF14f互作, 还与其他4个14-3-3蛋白亚型成员结合(GF14b、GF14c、GF14d和GF14e)。哺乳细胞中的研究发现R18能够与14-3-3蛋白结构保守槽中的结合位点Lys-49及Val-176结合, 故R18能够无亚型选择性的与14-3-3蛋白特异结合[14], 这与本研究的结果是一致的, 说明R18能够克服14-3-3蛋白亚型间遗传功能冗余的难题, 同时扰动14-3-3蛋白不同亚型与互作靶蛋白间的互作, 从而调控14-3-3蛋白的功能。笔者前期通过qRT-PCR的研究也发现, 在强弱势籽粒灌浆过程中, 除了GF14f外, 其余几个14-3-3蛋白亚型也在强弱势籽粒间存在着时空表达差异。据此, 笔者推测, 在籽粒中外源导入R18，或许能够同时扰动籽粒胚乳中14-3-3不同亚型蛋白, 从而达到调控弱势籽粒灌浆的目的。

籽粒中蔗糖转化及淀粉合成代谢途径关键酶活性低或者基因表达量低, 被认为是弱势籽粒相对强势籽粒灌浆结实差的一个重要的原因[3]。StSase、SuSase和 AGPase在弱势籽粒中的活性显著低于强势籽粒[21-22]。笔者前期借助差异蛋白组学方法, 发现StSase、AGPase及SuSase的相关蛋白在弱势籽粒中的表达显著低于强势籽粒[23]。通过蛋白互作的分析发现14-3-3蛋白亚型GF14f与上述部分蛋白成员(如SuS2、SS和AGPS)存在直接的互作关系, 进一步借助RNAi转基因材料发现特异减少GF14f蛋白在胚乳中的表达能够显著提高SuSase、AGPase及StSase酶的活性, 进而促进弱势籽粒的淀粉合成[7]。然而, 上述方法是通过反向遗传学的方法, 在RNA水平通过改变基因的表达量, 进而降低籽粒胚乳中GF14f蛋白的表达, 减少其与互作靶蛋白间的结合量, 从而实现调节GF14f蛋白功能的目的。本研究发现外源多肽配体R18能够在不改变GF14f蛋白表达量情况下, 竞争性的与GF14f蛋白结合, 通过改变GF14f蛋白与其互作靶蛋白间的结合力, 起到调节籽粒灌浆过程中GF14f蛋白功能的目的。哺乳动物细胞的研究表明, R18作为14-3-3的配体, 能有效阻断14-3-3与生理学激酶Raf-1的结合, 并有效抑制14-3-3蛋白与磷酸化的Bad和ASK1 (凋亡信号调节激酶1)以及未磷酸化的外酶S之间的相互作用[24], 从而达到调节酶活性的作用。本研究结果也表明, R18能够靶向扰动14-3-3蛋白亚型GF14f与SuS2、SS和AGPS蛋白间的结合, 进而释放SuSase、AGPase及StSase的酶活性, 起到促进弱势籽粒蔗糖转化及淀粉合成的作用。Gong等[25]针对水稻外显子结合体(EJC)的多肽配体研究也有类似的结果, 该团队针对EJC的核心 MAGO-Y14复合体, 获得了一个16个氨基酸的特异性多肽配体PAP, 进一步采用过表达的方法将PAP导入水稻中, 发现与MAGO和MAGO-Y14 RNAi干扰材料相比, PAP转基因水稻植株表现出相似或更加明显的表型特征。由此可见, 多肽配体策略能够通过扰动蛋白间的互作, 进而起到调节靶标蛋白功能的目的, 可作为RNAi技术的一个重要的补充策略, 在作物功能蛋白的研究中起到重要的作用。

本研究通过在灌浆初期外源涂抹R18的方法, 发现适当浓度的R18能够有效的提高弱势籽粒的千粒重和结实率。以往针对弱势籽粒调控技术研究一般从水肥调控层面进行探讨[26], 例如适当的前氮后移施肥技术[27], 灌浆期干湿交替的水分灌溉技术[28], 均能够有效的促进弱势籽粒灌浆, 但传统的水肥栽培管理措施主要是从水稻群体结构层面进行调控。近些年来, 大量与弱势籽粒灌浆密切相关的关键基因及蛋白被鉴定到[3-5,29], 逐步揭示了水稻弱势籽粒灌浆差的内在机制, 为建立弱势籽粒灌浆精准调控技术奠定了理论基础。本研究首次运用多肽配体策略, 以籽粒灌浆关键的蛋白14-3-3蛋白为靶标, 筛选能够靶向结合14-3-3蛋白的多肽配体R18, 在蛋白互作层面调控靶标蛋白的功能, 从而实现对弱势籽粒灌浆的精准调控。笔者认为, 本研究所采用的策略, 拓宽了作物栽培学研究的范畴, 证实了从分子层面探讨作物精准调控技术的可能性。接下来, 笔者将进一步探讨外源R18调控技术与水肥调控的有效结合, 从微观和宏观层面建立能精准调控弱势籽粒灌浆的分子生态栽培调控技术。

4 结论

多肽配体R18与水稻籽粒中14-3-3蛋白GF14f存在结合位点, 且R18能够无亚型选择性的与籽粒14-3-3蛋白不同亚型结合。R18竞争性的与GF14f蛋白结合, 导致GF14f与靶蛋白SuS2、SS和AGPS间的结合力减弱, 进而释放了籽粒灌浆过程中SuSase、StSase和AGPase的酶活性。籽粒灌浆期喷施适当浓度的R18能够有效的促进弱势籽粒的灌浆。

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Preliminary study of the peptide aptamer R18 promotes grain filling of rice inferior spikelets

ZHANG Zhi-Xing1,2, CHEN Hua1, MIN Xiu-Mei1, XU Hai-Long1, SONG Guo1, and LIN Wen-Xiong1,2,*

1College of Life Sciences, Fujian Agricultural and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujiang, China;2Fujian Provincial Key Laboratory of Agroecological Processing and Safety Monitoring, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujiang, China

14-3-3 protein plays an important role in plant growth and development. The high expression abundant of 14-3-3 isoform (GF14f) was an important reason for the poor grain-filling of rice inferior spikelets. In the present study, firstly we used molecular docking to study the most possible binding sites between GF14f protein and peptide aptamer R18. Furthermore,competitive experiment showed that the R18 could block GF14f binding to its interaction proteins, in turn, lead to a weakened interaction of GF14f with the SuS2, SS, and AGPS. Meanwhile,enzymatic assays showed that exogenous added R18 significantly increased the activity of sucrose synthase (SuSase), adenosine diphosphate-glucose pyrophosphorylase (AGPase), and starch synthase (StSase). Coimmunoprecipitation (Co-IP) experiments revealed that, in addition to GF14f, R18 could interacted with the other 14-3-3 isoforms, such as GF14b, GF14c, GF14d, and GF14e, which were further confirmed by Bimolecular Fluorescent Complimentary (BiFC) assay. These results also showed that the exogenous application (60 mg L–1) of R18 at grain-filling stage could significantly increase the activity of StSase, SuSase, and AGPase, resulting in the improvement of 1000-grain weight and seed-setting rate of rice inferior spikelets. In the present study, R18 had been investigated to competitively interfere with the interaction of rice 14-3-3 protein with multiple client proteins, weak the binding force, which increased the activity of sucrose conversion and starch synthesis related enzyme, resulting in the improvement of grain filling of rice inferior spikelets.

rice; inferior spikelets; grain filling; 14-3-3 protein; peptide aptamer

10.3724/SP.J.1006.2021.02049

本研究由国家自然科学基金项目(31871542)和国家重点研发计划项目(2018YFD0301105)资助。

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (31871542) and the National Key Research and Development Program of China (2018YFD0301105).

林文雄, E-mail: wenxiong181@163.com

E-mail: zhangzhixingfz@163.com

2020-07-18;

2020-12-01;

2021-01-09.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20210108.0908.002.html