硬粒小麦-长穗偃麦草附加系、代换系和易位系的创制

段亚梅 罗贤磊 陈士强 高 勇 陈建民,* 戴 毅

研究简报

硬粒小麦-长穗偃麦草附加系、代换系和易位系的创制

段亚梅1,2罗贤磊2陈士强3高 勇2陈建民1,2,*戴 毅1,*

1扬州大学农业科技发展研究院 / 教育部农业与农产品安全国际联合实验室, 江苏扬州 225009;2扬州大学生物科学与技术学院 / 江苏高校现代谷物生产协作中心, 江苏扬州 225009;3江苏省里下河地区农业科学研究所, 江苏扬州 225009

通过小麦与长穗偃麦草远缘杂交创制附加系、代换系及易位系是小麦遗传改良中利用长穗偃麦草优良基因的重要途径。本研究将长穗偃麦草特异分子标记、染色体计数、基因组原位杂交(GISH)及非变性原位杂交(ND-FISH)等多种方法相结合, 对硬粒小麦Langdon (AABB)与小偃麦8801 (AABBEE)的杂交后代群体进行分子细胞学鉴定, 创制出硬粒小麦-长穗偃麦草3E、6E染色体双体附加系Du-DA3E和Du-DA6E, 硬粒小麦-长穗偃麦草1E (1B)染色体双体代换系Du-DS1E (1B)以及硬粒小麦-长穗偃麦草1AS-1EL染色体易位系Du-T1AS·1EL。创制的4个种质中长穗偃麦草染色体均能稳定遗传, 这不仅增加了硬粒小麦-长穗偃麦草附加系和代换系的类型, 还为后续利用长穂偃麦草优良基因改良小麦提供了特殊种质资源。

硬粒小麦; 长穗偃麦草; 附加系; 代换系; 易位系

利用普通小麦(, AABBDD, 2=42)与其野生近缘种进行远缘杂交, 杂交后自发或人工染色体加倍形成完全或部分双二倍体, 这是将野生近缘种中优良外源基因导入普通小麦的前提[1], 也是普通小麦遗传改良的重要途径之一[2], 该途径同样适用于硬粒小麦(ssp., AABB, 2=28)的遗传改良。硬粒小麦是仅次于普通小麦的栽培小麦, 具有高面筋、高蛋白含量的优质性状, 但存在产量有限、易感赤霉病、根腐病等问题。与普通小麦相比, 硬粒小麦只有A、B两个基因组, 更容易和野生近缘种杂交, 获得含有外源基因组的小麦种质。例如, 刘大钧等[3]将簇毛麦(, VV)与硬粒小麦杂交选育了抗白粉病硬粒小麦-簇毛麦双二倍体(AABBVV); 硬粒小麦与四倍体长穗偃麦草()杂交创制的异源六倍体小偃麦8801(AABBEE)保留了长穗偃麦草抗多种小麦病害的优良性状[4-5]。

目前我国已育成普通小麦与黑麦()、长穗偃麦草、中间偃麦草()、滨麦()等野生近缘种的部分双二倍体[6]。这些部分双二倍体常常能够保留近缘种抗病、抗逆等优良性状, 是进一步创制附加系、代换系及易位系的桥梁亲本。国内外已利用双二倍体创制了小麦与黑麦、山羊草()、长穗偃麦草、簇毛麦、鹅观草()、赖草()等小麦近缘种的单体、双体、双端体多种类型的附加系[7-9]。小麦近缘种代换系可以在远缘杂交后代自发产生, 也可以通过单体代换法、缺体回交法等途径创制[10]。Hu等[11]在普通小麦与小麦-中间偃麦草部分双二倍体的杂交后代中选育出一个抗条锈病的小麦-中间偃麦草1St (1D)代换系。由于附加系、代换系等材料是向小麦导入完整的外源染色体, 因此染色体上优良基因和不利基因同时导入小麦中, 从而降低了外源优良基因在小麦遗传改良中的利用效应, 导致附加系、代换系不能直接应用于小麦育种中。易位系则是将含目标基因的小片段外源染色体导入到小麦中, 这将大大减少导入目标基因时带入的不良基因。而且, 外源染色体片段很小, 能够在小麦中更为稳定地保存下来。所以, 创制小片段易位系是利用近缘物种优良基因的有效途径。易位系可以由染色体间断裂错接自发产生, 也可以通过物理辐射或化学诱变剂诱导产生。通常是将小麦与近缘种杂交的F1代、双二倍体、附加系、代换系等带有外源染色体材料的种子、幼穗或花粉等进行辐射处理, 引起染色体的随机断裂, 在辐射后代中会产生大量的染色体结构变异[12-13], 当外源染色体片段与小麦染色体重接, 便可形成异源易位染色体。张璐璐等[14]通过60Co辐射处理中国春–长穗偃麦草7E代换系与扬麦16杂交的F2种子, 在其辐射后代中筛选到抗赤霉病的小麦–长穗偃麦草7EL整臂易位系。

长穗偃麦草是小麦远缘杂交中常用的野生种之一, 在其进化过程中经历了多种环境下长期的自然选择, 形成了许多栽培小麦不具有或已经丧失的优良性状, 如具有抗赤霉病、根腐病和麦二叉蚜(greenbug)等多种小麦病虫害的优良特性[15-21], 并且也具有耐盐、耐旱、耐涝等特性[22-24]。长穗偃麦草的E基因组与小麦的ABD组的亲缘关系较近[25], 使得其与小麦杂交比较容易获得可育后代, 将长穗偃麦草的基因导入到小麦中改良小麦的成功率较高, 因此常被用作小麦遗传改良的优异外源基因供体[25-26]。研究表明, 长穗偃麦草1E和7EL染色体上带有赤霉病抗性基因[27-29], 并成功在十倍体长穗偃麦草7el2L染色体上克隆了抗赤霉病基因, 将携带的染色体片段转移至普通小麦品种, 可选育出抗赤霉病新品种[21]。Jauhar等[30-32]利用硬粒小麦与二倍体长穗偃麦草杂交并多次回交, 获得了硬粒小麦-长穗偃麦草1E双体附加系, 并进一步创制了1E (1A)和1E (1B)双体代换系, 其中1E附加系与1E (1A)代换系具有赤霉病抗性。Liu等[9]创制出的硬粒小麦–长穗偃麦草7E双体附加系同样具有赤霉病抗性, 进一步证明了7E染色体上带有赤霉病抗性基因。另外, 长穗偃麦草3E染色体上有黄矮病毒抗性基因; 1E和6E染色体上有抗叶枯病基因[33]; 3E、4E和5E染色体上有耐盐基因[34-35]。将这些优良基因导入小麦中, 可拓宽小麦的遗传基础。

普通小麦中已经有全套长穂偃麦草附加系、代换系, 而染色体数目比普通小麦少的硬粒小麦却没有成套类似的材料, 仅有1E、7E附加系以及1E (1A)和1E (1B)代换系。本研究利用长穗偃麦草特异分子标记、染色体计数、基因组原位杂交(genomehybridization, GISH)及非变性原位杂交(non-denaturing fluorescencehybridization, ND-FISH)等多种方法, 对硬粒小麦(Langdon)与小偃麦8801的杂交F4~F6群体进行染色体组成的分子细胞学鉴定, 从中筛选出硬粒小麦-长穗偃麦草双体附加系及代换系, 为完善全套硬粒小麦-长穗偃麦草附加系、代换系增加特定种质资源。

1 材料与方法

1.1 植物材料

硬粒小麦Langdon、普通小麦中国春、二倍体长穗偃麦草(2=14, EeEe, PI 531718)、四倍体长穗偃麦草(2=28, Ee1Ee1Ee2Ee2, PI 531749)和异源六倍体小偃麦8801[4-5](, 2=42, AABBEE), 以上种质由加拿大农业部渥太华研究发展中心(AAFC-Ottawa Research and Deve­lopment Center) Dr. Fedak惠赠(表1)。从小偃麦8801与Langdon杂交的F2代群体中选择染色体数为2=29, 并且具有长穗偃麦草特异标记扩增的植株进行种植, 在F4~F6代群体中通过分子标记、细胞学等方法选育硬粒小麦–长穗偃麦草附加系和代换系。

1.2 分子标记检测

DNA采用改良SDS法提取供试材料的基因组, 参照王景雪等[36]的方法进行。选择20个本研究依据 SLAF-seq法[37]开发的长穂偃麦草特异分子标记和4个已发表的分子标记[38](附图1和附图2), 对Langdon与小偃麦8801杂交F2代及F4~F6代植株进行PCR扩增, 检测硬粒小麦背景中的长穗偃麦草遗传物质。所用标记及引物序列见表2。PCR扩增体系为25 μL, 包括1 μL模板DNA、12.5 μL 2×MasterMix (CWBIO, Art. No. CW0682M)、正向和反向引物各1 μL, 以及9.5 μL ddH2O。依据2×MasterMix的说明书进行PCR扩增。1%的琼脂糖胶检测PCR扩增产物, 恒压120 V的条件下电泳30 min, 然后在凝胶成像仪下照相。

表1 本研究所用的植物材料

1.3 有丝分裂中期染色体制片

取28℃培养箱中萌发种子的根置于1~4℃冰水处理24~30 h, 用90%乙酸固定8 min (或卡诺固定液固定过夜), 然后移入70%酒精–20℃保存备用。参照Kato等[39]的酶解滴片法制片: 从70%酒精中取出根尖, 用ddH2O洗涤3次, 将根尖分生组织切下, 放入2%纤维素酶和1%果胶酶混合液中37℃水浴1 h, 每个根尖酶总量20 μL。酶解后70%酒精洗2次, 每次2 min, 解剖针捣碎根尖和涡旋震荡10 s, 4000转 min–1离心2 min倒出酒精, 加入25~50 μL 根–1100%乙酸涡旋5 s成细胞悬浮液。每制片滴加8 μL细胞悬浮液, 10 min之后相差显微镜下进行染色体计数, 每单株染色体计数至少20个细胞, 每个F4代株系取10株进行染色体计数。标出染色体数完整且分散良好的细胞位置, 将制片置于–70℃冰箱中保存备用。

1.4 非变性荧光原位杂交(ND-FISH)

以Oligo-pSc119.2、Oligo-pAs1作为组合探针进行ND-FISH分析[40]。Oligo-pSc119.2 (5′-CCGTTTTGTGGA CTATTACTCACCGCTTTGGGGTCCCATAGCTAT-3′)的5′端由6-羧基荧光素(6-FAM)标记, Oligo-pAs1 (5′-CCTTTCT GACTTCATTTGTTATTTTTCATGCATTTACTAATTATTTTGAGCTATAAGAC-3′)的5′端由6-羧基四甲基罗丹明(Tamra)标记。由上海英骏公司合成探针。根据染色体制片数配制杂交液: 0.3 μL探针/片+8 μL工作液/片(由pH 7.0的1× TE和2× SSC按体积比1∶1混合而成)。每制片加8 μL混匀的杂交液, 盖上盖玻片, 放置于密闭湿盒中37℃杂交8 h。杂交完成后将制片放入2×SSC室温洗脱5 min, 晾干后加8 μL的荧光染料DAPI (VECTOR, H-1200)复染10 min, 在Nikon (Ni-U)荧光显微镜下观察, Nikon DS-Qi1Mc照相, NIS-Elements D4.30.00合成图片, Adobe Photoshop CS5进行图片处理。

1.5 基因组原位杂交(GISH)

非变性原位杂交后的制片置于2×SSC中洗脱2 min, 转移到70%酒精中洗脱20 min后凉干, 转入100%酒精中脱水1 h后进行基因组原位杂交。缺口平移法标记二倍体长穗偃麦草基因组DNA作为探针(Roche, USA, 货号: 11745816910)。探针标记反应体系为20 μL, 包括2 μL模板DNA (500 ng μL‒1)、4 μL DIG-Nick-Translation Mix及14 μL的ddH2O。15℃下反应90 min后, 加入1 μL的0.5 mol μL‒1EDTA (pH 8.0)终止反应和保存于–20℃备用。参照顾爱侠等[41]的方法, 制备硬粒小麦Langdon的基因组DNA作为封阻, 浓度为探针DNA的50~200倍。GISH杂交和洗涤按Liu等[9]的方法, 杂交后制片经系列洗涤后在Nikon (Ni-U)荧光显微镜下观察, Nikon DS-Qi1Mc照相。

表2 长穗偃麦草特异分子标记及序列

1.6 农艺性状特征

为了解硬粒小麦背景中导入不同长穗偃麦草染色体的农艺性状表现, 田间种植创制材料, 随机排列, 每行10株, 株距10 cm, 每个材料种植3行, 行距30 cm。对所有成活植株的株高、穗长、小穗粒数、每穗小穗数、每穗粒数、千粒重、旗叶面积等农艺性状进行观察统计。株高为小麦地上部分到主穗穗顶的高度(不含芒长); 穗长为穗茎节至穗顶部的长度(不含芒长); 旗叶面积=旗叶长×旗叶宽×0.83[42]。所得数据用软件IBM SPSS Statistics 21.0进行分析, 分析方法为单因素方差分析(One-way ANOVA), 用最小显著差法(LSD0.05)检验平均数。

2 结果与分析

2.1 含有E染色体植株的选择

理论上, 硬粒小麦Langdon与小偃麦8801杂交F2代植株的染色体数目分布范围为28~42。其中染色体数为29条的植株中包含硬粒小麦的28条染色体和1条来自8801中的长穗偃麦草E染色体, 从其自交后代中可以获得硬粒小麦-长穗偃麦草双体附加系。对F2代的114个单株进行染色体计数, 选出22个2= 29的单株, 利用3个长穗偃麦草基因组分子标记进行检测, 在22个单株中, 3个标记均能扩增条带的有15株, 2个标记能扩增条带的有2株, 1个标记能扩增条带的有1株, 完全没有扩增条带的有4株(图1-a1~a3)。结合染色体计数结果, 3个标记都能扩增条带的单株染色体数符合预期, 将这些F2单株收获并连续自交。

15个F2植株经连续自交选择后, 获得10个F4代株系群体, 株系内随机选择10株左右, 用长穗偃麦草基因组分子标记进行鉴定, 有4个株系内所有单株扩增条带一致(图1-b1~b4), 分别为F2-13-6-7、F2-10-9-1、F2-6-14-1及F2-13-9-3。这4个株系的所有单株均能扩增出目的条带, 说明每个单株都含有长穗偃麦草染色体, 初步认为是稳定的含有长穗偃麦草染色体的新种质。这4个株系来自于3个不同的F2单株, 分别定名为Du_No.1 (F2-13-6-7)、Du_No.3 (F2-10-9-1)、Du_No.6 (F2-6-14-1)及Du_No.8 (F2-13-9-3)。

a1~a3: F2代的标记扩增。M: DL2501 marker; 1~22: F2代植株; 23: Ld; 24: 4X; 25: 8801。a1: 标记GSM-1; a2: 标记GSM-2; a3: 标记GSM-3. b1~b4: F4代的标记GSM-3扩增. M: DL2501 marker; 1~13: F4代单株; b1: 株系Du_No.1; b2: 株系Du_No.3; b3: 株系Du_No.6; b4: 株系Du_No.8; 14: Ld; 15: 4X; 16: 8801。

a1–a3: amplification of markers in F2generation. M: DL2501 marker; 1–22: different plants of F2generation; 23: Ld; 24: 4X; 25: 8801. a1: markers GSM-1; a2: marker GSM-2; a3: marker GSM-3. b1–b4: amplification of marker GSM-3 to F4generation. M: DL2501 marker; 1–13: different plants of F4generation; b1: line Du_No.1; b2: line Du_No.3; b3: line Du_No.6; b4: line Du_No.8; 14: Ld; 15: 4X; 16: 8801.

2.2 利用染色体特异分子标记确定株系属性

为明确F4代株系中所附加的E染色体属性, 选择1E~7E染色体分子标记各1个, 对4个株系进行初步检测, F5代用21个染色体分子标记再次进行鉴定, 确保外源染色体的准确性(表3和图2)。来自于同一F2单株的株系Du_No.1和Du_No.8均能扩增出1E染色体特异条带, 但两者之间存在差异。株系Du_No.1能够扩增出1E长臂和短臂的所有7个1E染色体分子标记, 而株系Du_No.8仅扩增出1E长臂(1EL)的5个标记(图3-a), 不能扩增出1E短臂(1ES)的2个标记(图3-b)。5个3E染色体分子标记均能在株系Du_No.3中扩增出特异条带, 同样5个6E染色体分子标记均能在株系Du_No.6中扩增出特异条带。此外, 对4个株系的F6代利用与F5相同的标记进行PCR扩增, 各株系随机选择的单株均能扩增出对应染色体的特异条带(扩增条带与F5相同未给出), 说明F5植株中E染色体成对存在, 自交后代并未发生E染色体丢失。因此认为这4个株系稳定, 株系Du_No.1含有1E染色体, 而株系Du_No.8含有1E长臂而没有1E短臂, 株系Du_No.3含有3E染色体, 株系Du_No.6含有6E染色体。

2.3 细胞学鉴定染色体组成

株系Du_No.1和Du_No.8的染色体数为28, 株系Du_No.3和Du_No.6的染色体数为30 (图4)。从F4代随机植株的染色体分子标记鉴定结果可见Du_No.3和Du_No.6为硬粒小麦-长穗偃麦草附加系。而2=28的2个株系Du_No.1和Du_No.8虽然染色体数与硬粒小麦Langdon相同, 株系Du_No.1可扩增出1E染色体标记, 而株系Du_No.8仅扩增出1E长臂标记而没有1E短臂, 则可以推测这2个株系可能为硬粒小麦-长穗偃麦草代换系或易位系。

对4个株系的F5代单株进行了同一分裂相的连续2次原位杂交分析。GISH结果显示, 株系Du_No.3及Du_No.6的植株的30条染色体中均含有2条E染色体(图5-a1, b1)。ND-FISH结果显示, 2个株系均含有完整的28条AB基因组染色体(图5-a2, b2), 以及2条信号分布相同的长穗偃麦草染色体。将株系Du_No.3 (图5-a3)和Du_No.6 (图5-b3)中的E 染色体与8801的ND-FISH核型比较[43], 可以确定株系Du_No. 3中的长穗偃麦草染色体信号分布与8801中3E染色体一样(图5-a4)。同理, 株系Du_No.6中的E染色体信号分布与8801中的6E (图5-b4)相同。因此, 证实分子标记鉴定结果和确定株系Du_No.3为硬粒小麦-长穗偃麦草3E双体附加系(Du-DA3E), 株系Du_No.6为硬粒小麦-长穗偃麦草6E双体附加系(Du- DA6E)。

表3 长穗偃麦草染色体特异分子标记扩增结果

“+”表示能够扩增目的条带; “–”表示不能扩增目的条带; “*”表示未用该标记对植株进行扩增。

“+” indicates the presence of the target band; “–” indicates the absence of the target band; “*” indicates that the plant has not been amplified using this marker.

M: DL2501 marker; a: 株系Du_No.1, 标记为CSM-1E-1; b: 株系Du_No.3, 标记为 CSM-3E-1; c: 株系Du_No.6, 标记为CSM-6E-4; d: 株系Du_No.8, 标记为CSM-1E-1; 1: Ld; 2: CS; 3: 4X; 4: 8801; 5~14: 各株系的不同单株。

M: DL2501 marker; a: line Du_No.1, marker CSM-1E-1; b: line Du_No.3, marker CSM-3E-1; c: line Du_No.6, marker CSM-6E-4; d: line Du_No.8, marker CSM-1E-1; 1: Ld; 2: CS; 3: 4X; 4: 8801; 5–14: different plants of F5generation.

M: DL2501 marker; a: 1E长臂(1EL)标记CSM-1E-3; b: 1E短臂(1ES)标记 CSM-1E-4; 1: Ld; 2: CS; 3: 4X; 4: 8801。5~9: 随机选取的单株。

M: DL2501 marker; a: CSM-1E-3, amplified the long arm of 1E chromosome (1EL); b: CSM-1E-4, amplified the short arm of 1E chromosome (1ES); 1: Ld; 2: CS; 3: 4X; 4: 8801. 5–9: randomly selected individual plant.

a: 株系Du_No.1, 2=28; b: 株系Du_No.3, 2=30; c: 株系Du_No.6, 2=30; d: 株系Du_No.8, 2=28。

a: line Du_No.1, 2=28; b: line Du_No.3, 2=30; c: line Du_No.6, 2=30; d: line Du_No.8, 2=28.

株系Du_No.1的F5代GISH结果显示, 该株系含有2条E染色体(图5-c1), ND-FISH分析显示2条E染色体为同源染色体(图5-c2), 且这2条E染色体的信号分布(图5-c3)与亲本8801的1E染色体信号相同(图5-c4); 此外, 株系Du_No.1中缺少小麦1B染色体(图5-c5), 表明株系Du_No.1中的1B染色体被长穗偃麦草1E染色体代换, 证实分子标记鉴定结果, 株系Du_No.1为硬粒小麦-长穗偃麦草1E (1B)双体代换系, 即Du-DS1E (1B)。

株系Du_No.8和Du_No.1来自于同一F2单株, 但Du_No.8的F5代GISH结果与株系Du_No.1不同, 其中有2条硬粒小麦-长穗偃麦草整臂易位染色体(图5-d1)。ND-FISH分析显示, 2条易位染色体信号相同, 且硬粒小麦染色体组中缺少2条完整1A染色体(图5-d2)。将易位染色体上的信号分布与亲本8801的ND-FISH核型图对比发现, 株系Du_No.8中的易位染色体(图5-d3)由硬粒小麦1A染色体短臂(图5-d5)和长穗偃麦草1E染色体长臂(图5-d4)组成, 结合分子标记鉴定的结果, 株系Du_No.8为硬粒小麦-长穗偃麦草1AS-1EL易位系, 即Du-DT1AS·1EL。

2.4 农艺性状的初步分析

本研究对获得的4个株系进行农艺性状观察。从穗部形态看, 各株系和亲本Langdon更为接近, 但株系之间存在差异, 表明不同E染色体的导入对硬粒小麦的外形影响程度不同。4个株系的株高、穗长、每穗小穗数、每穗粒数等农艺性状统计见表4。

4个株系的株高和旗叶面积均与Langdon有明显区别, 株高显著低于Langdon, 旗叶面积显著大于Langdon (< 0.05), 类似于另一亲本8801。附加系Du-DA3E的穗长、小穗粒数及每穗粒数均与Langdon无显著性差异, 但每穗小穗数及千粒重均低于Langdon。种子形态介于2个亲本之间, 略瘪, 带有少许冠毛(图6-C), 穗部形态与Langdon相似(图6-c)。附加系Du-DA6E的穗长、小穗粒数及每穗粒数均显著高于Langdon。种子形态较为接近Langdon (图6-D), 穗大且多粒饱满(图6-d), 每穗粒数和千粒重在创制材料中最高。代换系Du-DS1E (1B)的穗长大于Langdon, 每穗小穗数与Landon无显著性差异, 但小穗粒数、每穗粒数及千粒重均显著小于Langdon (< 0.05)。种子形态较为接近8801, 干瘪且冠毛较长(图6-E), 穗部形态也偏向于8801 (图6-e)。易位系Du-T1AS·1EL的穗长、小穗粒数、每穗小穗数及每穗粒数均与Langdon无显著性差异, 但千粒重低于Langdon。种子形态较为接近Langdon (图6-F), 穗部形态介于两个亲本之间(图6-f)。

3 讨论

3.1 硬粒小麦-长穗偃麦草附加系、代换系和易位系的创制

利用小麦-近缘种完全或部分双二倍体与小麦杂交, 获得单体附加系, 再通过自交得到双体附加系是创制小麦-近缘种质双体附加系最简单、最经典的方法[44]。本研究通过硬粒小麦Langdon与小偃麦8801杂交, 获得的F1代中包含14对AB组同源染色体和7条E组染色体, F1代在减数分裂时, AB组同源染色体正常配对, 7条E染色体没有可配对的同源染色体, 因此随机分配到不同的配子中。根据这个特点, 在F2代群体中通过分子标记、细胞学检查, 选出仅含有一条外源染色体的植株连续自交, 最终从F4代群体中筛选出硬粒小麦–长穗偃麦草3E和6E双体附加系Du-DA3E和Du-DA6E。这说明在硬粒小麦与小偃麦8801杂交的2个F2单株Du_No.3 (F2-10-9-1)和Du_No.6 (F2-6-14-1)中附加了不同E染色体, 并在自交过程中E染色体通过雌雄配子传递成功保存下来, 最终获得稳定株系。

在F4代群体中除获得附加系外, 还获得一个代换系Du-DS1E (1B)和一个整臂易位系Du-T1AS·1EL。代换系和易位系来自同一F2单株(F2-13), 均涉及1E染色体, 但自交后代出现不同类型的材料, 说明在自交过程中可能自发产生了染色体的代换和结构变异。自发代换通常发生在部分同源群内染色体间, 由于这些染色体间存在一定的同源性, 使得近缘种染色体与小麦染色体在减数分裂中产生错误配对而被保留, 最后小麦染色体丢失, 这种代换因染色体补偿性较好而能够稳定地保留在小麦背景中。Garg等[45]在小麦-长穗偃麦草1E附加系的后代中发现1D染色体丢失而自发形成1E (1D)代换系。由此可见, 本研究获得的1E (1B)代换系也是1E和1B染色体进行了错误配对, 而自发产生了1E (1B)代换系。

在减数分裂过程中单价体自发发生断裂形成端着丝点染色体, 当外源的端着丝点染色体与小麦的端着丝点染色体融合、重接, 便会形成异源的整臂易位染色体[46]。本研究获得的稳定易位系中易位染色体为1AS-1EL, 可以推测某世代的单株在减数分裂过程中, 1A和1E染色体在着丝点处断裂和染色体错误连接产生了易位染色体1AS-1EL, 最后产生了稳定易位个体。理论上, F1代单株中不同花粉母细胞发生部分同源染色体的错误配对、着丝点断裂和断裂染色体的错误连接, 可以产生涉及不同E染色体的代换系和易位系。由此可见, 在附加系构建的群体中, 扩大F2代的检测植株数, 有可能获得自发产生的多个代换系、易位系或其他特殊类型材料。

3.2 外源染色体高效精准的鉴定方法

小麦背景中鉴定外源遗传物质常用的方法有形态学观察、细胞学鉴定、分子标记检测及原位杂交等。形态学观察直观、简便快捷, 可初步判断是否含有外源染色体。通过染色体计数也能判断是否含有外源染色体, 但不能确定代换系和易位系。染色体分带技术在小麦背景中区别外源染色体具有一定的可靠性, 但这种技术的稳定性和操作的复杂性使得该技术的应用受到限制。目前应用较多的是分子标记检测及原位杂交分析。分子标记可精确检测小麦背景中的少量外源遗传物质, 但无法确定外源染色体在细胞中的存在性质[47]。原位杂交技术在小麦远缘杂交中常被用来分析染色体组成及变化, 不仅能够检测外源染色体, 还能分析小麦族染色体组间同源关系。GISH分析能够明显地标记出小麦背景中的外源染色体或染色体片段, 但无法识别具体染色体, 也无法确定发生易位的所属染色体。利用重复序列获得的染色体FISH核型图可以更准确鉴定小麦背景中外源染色体的属性[48]。因此, 组合多种技术来鉴定小麦背景中外源染色体, 是目前应用最多的方式。本研究选择了分子标记鉴定、染色体计数、GISH及ND-FISH四种鉴定方法, 共同对硬粒小麦背景中长穗偃麦草的具体染色体进行鉴定。首先对F2群体中大量的单株进行染色体计数, 利用长穗偃麦草基因组分子标记对获选植株进行PCR扩增检测, 排除不含长穗偃麦草染色体的单株, 在F4代利用长穗偃麦草染色体分子标记再进行选择。如在F2代就利用染色体分子标记进行鉴定, 可以使鉴定对象和规模在低世代得到一定的控制, 从而提高后续鉴定工作的效率。对确定含有长穗偃麦草染色体的植株自交后代进行分析, 分子标记和GISH结合可以确定染色体数2= 30的株系为硬粒小麦–长穗偃麦草特定染色体附加系。但染色体数目为2= 28的株系, 分子标记和GISH难以确定代换系中哪条硬粒小麦染色体被代换, 以及染色体易位发生在哪条硬粒小麦染色体上。因此, 对同一细胞分裂相进行GISH和ND-FISH分析, 通过识别硬粒小麦和长穗偃麦草染色体, 并与亲本8801中E染色体ND-FISH核型图比较[43], 最终直观、准确无误的明确附加系中具体E染色体, 代换系中的E染色体和被代换的硬粒小麦染色体, 以及易位系中易位染色体的组成。首先经细胞学、分子标记鉴定明确了F2代单株衍生的选择群体, 再经原位杂交进行精准鉴定, 这样从细胞学、分子标记鉴定开始一直到ND-FISH分析得出最终结论, 大大降低了外源遗传物质鉴定的时间和工作量, 而且后续结果验证前期结果, 使得硬粒小麦–长穗偃麦草各种类型材料的筛选更加快速和准确。

a1: 株系Du_No.3 GISH; a2: 同一分裂相的ND-FISH; a3: a2图中E染色体; a4: 8801的3E染色体。b1: 株系Du_No.6 GISH; b2: 同一分裂相的ND-FISH; b3: b2图中E染色体; b4: 8801的6E染色体。c1: 株系Du_No.1 GISH; c2: 同一分裂相的ND-FISH; c3: c2图中E染色体; c4: 8801的1E染色体; c5: 8801的1B染色体。d1: 株系Du_No.8 GISH; d2: 同一分裂相的ND-FISH; d3: d2图中E染色体; d4: 8801的1E染色体; d5: 8801的1A染色体。GISH中绿色信号为长穗偃麦草染色体, ND-FISH中箭头所指为长穗偃麦草染色体。标尺为10 μm。

a1: GISH of line Du_No.3; a2: ND-FISH on the same metaphase; a3: the E chromosomes in a2; a4: the 3E chromosome of 8801. b1: GISH of line Du_No.6; b2: ND-FISH on the same metaphase; b3: the E chromosomes in b2; b4: the 6E chromosome of 8801. c1: GISH of line Du_No.1; c2: ND-FISH on the same metaphase; c3: the E chromosomes in c2; c4: the 1E chromosome of 8801; c5: the 1B chromosome of 8801. d1: GISH of line Du_No.8; d2: ND-FISH on the same metaphase; d3: the E chromosomes in d2; d4: the 1E chromosome of 8801; c5: the 1A chromosome of 8801. The green fluorescence signals show the chromosomes ofin GISH. The arrows refer to chromosomes ofin ND-FISH. Bar: 10 μm.

表4 硬粒小麦-长穗偃麦草附加系、代换系等及其亲本的农艺性状

不同字母差异显著(< 0.05)。

Different lowercase letters represent significant differences at< 0.05.

A, a: Langdon; B, b: 8801; C, c: 附加系Du-DA3E; D, d: 附加系Du-DA6E; E, e: 代换系Du-DS1E(1B); F, f: 易位系Du-T1AS·1EL。标尺为10 mm。

A, a: Langdon; B, b: 8801; C, c: addition line Du-DA3E; D, d: addition line Du-DA6E; E, e: substitution line Du-DS1E(1B); F, f: translocation line Du-T1AS·1EL. Bar: 10 mm.

3.3 硬粒小麦背景中长穗偃麦草染色体的稳定性和价值

目前普通小麦中有整套长穗偃麦草双体附加系和代换系, 但硬粒小麦中尚未创制出全套类似材料。Jauhar等[30]在硬粒小麦-长穗偃麦草1E附加系的后代群体中发现有5%的植株出现外源染色体丢失一条或全部丢失的现象; Liu等[9]在创制硬粒小麦-长穗偃麦草7E附加系中同样也发现少数双体附加系植株染色体数恢复成2= 29, 甚至有外源染色体完全丢失的现象; 李海凤等[49]研究长穗偃麦草染色体在硬粒小麦背景中的传递特征也显示即便获得了双体附加系, 在自交后代中外源染色体也容易丢失; 也有报道认为2E和4E染色体仅通过雄配子传递, 所以自交后代未见双体2E、4E附加系[38]。这些研究表明硬粒小麦背景中外源染色体易丢失, 造成这种现象很有可能是由于四倍体硬粒小麦接受外源染色体的缓冲性较差, 而且短时间内外源染色体与硬粒小麦染色体间还没有发生适当的重排来达到新的平衡。因而, 硬粒小麦背景中至今仍然难以获得全套稳定的双体附加系、代换系[49-50]。

本研究创制的硬粒小麦–长穗偃麦草附加系, 代换系和易位系中外源染色体能够稳定遗传, 并没有出现染色体丢失的现象, 这不仅增加了硬粒小麦背景中长穗偃麦草的附加系和代换系类型, 还为硬粒小麦的改良提供了中间种质。例如, 4个材料的株高均低于亲本Langdon, 这将有利于提高硬粒小麦抗倒伏能力。旗叶面积的大小与小麦的产量密切相关[51], 创制的4个材料旗叶面积都大于Langdon, 这将适用于提高硬粒小麦产量的研究。附加系Du-DA6E的穗长、小穗粒数、每穗粒数均显著高于Langdon, 这是否与6E染色体上存在提高产量相关性状的基因有关[52-53], 值得进一步研究。此外有研究认为, 1E染色体带有编码种子储藏蛋白基因, 将1E染色体导入小麦并替代对面包制作品质具有消极影响的1A染色体, 将可能提高小麦成品品质[45]。Kumar等[54]将1E染色体长臂替换掉对面团筋力有减弱或消极影响的1A长臂, 创制出普通小麦–长穗偃麦草1AS-1EL易位系, 从而使面团筋力得以提高。因此, 对硬粒小麦–长穗偃麦草易位系Du-T1AS·1EL中的种子储藏蛋白特性进行研究, 将有利于Du-T1AS·1EL作为中间材料应用到小麦加工品质性状的遗传改良中。

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附图1 基于中国春-长穂偃麦草附加系中的扩增结果选择染色体特异分子标记

Fig. S1 Selection of chromosomal-specific molecular markers based on the amplification results in CS-addition lines

M: DL2501 marker; 1~7: 中国春-长穗偃麦草1E-7E附加系; 8:(2); 9: Ld; 10: CS; 11: 8801。标记依次为: CSM-1E-1, CSM-2E-1, CSM-3E-5, CSM-4E-1, CSM-5E-1, CSM-6E-2, CSM-7E-1, GSM-2。

M: DL2501 marker; 1–7:1E-7E addition lines; 8:(2); 9: Ld; 10: CS; 11: 8801. Specific markers: CSM-1E-1, CSM-2E-1, CSM-3E-5, CSM-4E-1, CSM-5E-1, CSM-6E-2, CSM-7E-1, GSM-2.

附图2 1E染色体特异分子标记在中国春-长穂偃麦草1E端体附加系中的扩增结果

Fig. S2 PCR amplification of the 1E chromosome-specific molecular markers in CS-1E telodisomic addition lines

M: DL2501 marker; a: 标记CSM-1E-3, 扩增1E长臂(1EL); b: 标记CSM-1E-4, 扩增1E短臂(1ES)。1: 中国春-长穂偃麦草1E附加系(DA1E); 2: 中国春-长穂偃麦草1EL端体附加系(DA1EL); 3: 中国春-长穂偃麦草1ES端体附加系(DA1ES); 4: 长穂偃麦草(2); 5: Ld。

M: DL2501 marker; a: CSM-1E-3, amplified the long arm of the 1E chromosome (1EL); b: CSM-1E-3, amplified the short arm of the 1E chromosome (1ES). 1: CS1E addition line; 2: CS1EL telodisomic addition line (DA1EL); 3: CS1ES telodisomic addition line (DA1ES); 4:(2); 5: Ld.

Creation of disomic addition, substitution and translocation lines of durum wheat-

DUAN Ya-Mei1,2, LUO Xian-Lei2, CHEN Shi-Qiang3, GAO Yong2, CHEN Jian-Min1, 2,*, and DAI Yi1,*

1Institute of Agricultural Science and Technology Development / Joint International Research Laboratory of Agriculture & Agri-Product Safety of MOE, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu, China;2College of Bioscience and Biotechnology / Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu, China;3Institute of Agricultural Sciences, Lixia River Region, Yangzhou 225009, Jiangsu, China

The establishment of chromosome addition, substitution and translocation lines through distant hybridization between wheat andis an important approach to utilize useful genes ofin wheat improvement. Based on chromosome-specific molecular markers, chromosome counting, genomehybridization (GISH), and non-denaturing fluorescencehybridization (ND-FISH), several stable addition, substitution or translocation lines were identified from a cross betweenssp.Langdon (AABB) and8801 (AABBEE). Two 3E and 6E disomic addition lines Du-DA3E and Du-DA6E of durum wheat-, a 1E (1B) disomic substitution line Du-DS1E (1B), and a 1AS-1EL disomic translocation line Du-T1AS·1EL were created in this study. The chromosome-segments ofcould be inherited stably in these new lines, which not only increased the types of addition and substitution lines of durum wheat, but also provided special germplasm resources for the follow-up use of excellent genes ofin wheat improvement.

;; addition line; substitution line; translocation line

10.3724/SP.J.1006.2021.01072

本研究由江苏省自然科学基金项目(BK20180908, BK20181213)和扬州市自然科学基金项目(YZ2018097)资助。

This research was supported by the Natural Science Foundation of Jiangsu (BK20180908, BK20181213) and the Natural Science Foundation of Yangzhou (YZ2018097).

戴毅, E-mail: daiyi@yzu.edu.cn; 陈建民, E-mail: jmchen@yzu.edu.cn

E-mail: 834630650@qq.com

2020-09-04;

2020-12-02;

2020-12-28.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20201228.0946.004.html