甘蔗抗黄锈病G1标记的分子检测及候选抗病基因WAK的分析

王恒波 陈姝琦 郭晋隆 阙友雄

甘蔗抗黄锈病G1标记的分子检测及候选抗病基因的分析

王恒波 陈姝琦 郭晋隆 阙友雄*

福建农林大学农业农村部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室 / 国家甘蔗工程技术研究中心, 福建福州 350002

甘蔗黄锈病是屈恩柄锈菌(Butler)引起的一种世界性真菌病害, 导致产量减少和糖分降低, 给甘蔗产业造成严重损失。本研究采用抗黄锈病分子标记G1, 检测我国和世界上重要的甘蔗栽培品种、野生种和近缘属的抗黄锈病基因, 并对扩增的代表性特异条带进行克隆测序、功能注释和聚类分析, 推测其抗性基因的起源和进化。G1检测结果表明, 国内124份甘蔗栽培品种检测到G1标记的有83份, 占66.9%; 国外46份甘蔗栽培品种检测到G1标记的有31份, 占67.4%。34份甘蔗野生种和近缘属中检测到G1标记的有17份, 占50%, 其中割手密种含有该基因比例最高, 为100%。功能注释揭示, G1标记的候选基因编码一种细胞壁连接的类受体激酶, 并在甘蔗栽培品种的单倍体蛋白组数据库中鉴定到3个相似度较高的蛋白, 这些蛋白都有细胞壁受体激酶结构的胞外域、跨膜域和激酶活性的胞内域。聚类结果则清晰展示了抗病候选基因的起源及进化关系, 具体可分为3组, 第1组来源于割手密种和大茎野生种; 第2组来源于大茎野生种、热带种和河八王属; 第3组来源于割手密种、大茎野生种、中国种和栽培品种。研究结果为抗黄锈病甘蔗品种的选育提供重要的抗源支撑, 并为抗性分子机制的解析奠定基础。

检测; 分子标记; 类受体激酶; 黄锈病; 甘蔗

甘蔗作为世界上最重要的糖料和能源作物之一,供应全世界食糖总产的80%和生物能源的60%[1]。同时, 甘蔗也是植物遗传学、多倍体基因组学研究的一种热点植物。甘蔗锈病是一种重要的流行性真菌病害, 给蔗糖产业带来巨大经济损失, 包括2个类型, 即分别由黑顶柄锈菌(Syd. et P. Syd.)和屈恩柄锈菌(Butler.)[2]引起的褐锈病和黄锈病。甘蔗黄锈病最早在澳大利亚发现, 2000年大流行于甘蔗栽培品种Q124[3]。与甘蔗褐锈病相比, 甘蔗黄锈病发病的区域范围相对较窄, 主要分布在澳大利亚、美国、印度、巴西等国家的部分地区[3-5], 近年来发病蔗区呈现逐年扩大趋势, 引起甘蔗科技工作者尤其是育种家的广泛关注和高度重视。王晓燕等[6]于2014年在我国云南蔗区首次发现甘蔗黄锈病, 表明该病害在中国蔗区也存在流行发生的风险。因此, 对我国甘蔗种质资源的黄锈病抗性, 在精准检测的基础上, 进行系统地分析评价和抗性溯源, 具有十分重要的理论和实践意义。

甘蔗为遗传背景复杂、基因组庞大的多倍体植物, 尚未有利用基因定位方法获得抗病基因的报道。目前, 利用分子标记辅助育种技术, 选育和种植抗病品种是防治甘蔗病害最为经济有效的方法之一。例如: 在法国的栽培品种R570上, 发现和定位到抗褐锈病的基因, 被证实对多个国家和地区的褐锈病分离物具有广谱抗性, 现已开发出与基因紧密连锁的2个分子标记(R12H16和9O20-F4), 已经作为诊断标记在甘蔗抗褐锈病品种的选育中得到了广泛的应用[7-8]。此外, Yang等[1]在利用CP95-1039和CP88-1762杂交的拟“F1”分离群体, 鉴定到1个对表型贡献率为58%的QTL位点(qORR109), 进而开发了抗黄锈病基因的分子诊断标记G1, 为鉴定甘蔗黄锈病种质资源提供了一个重要的技术方法。Yang等[1]根据Unigene序列(转录本ID: Seq_695109)设计了基因特异性标记G1, 其候选基因和高粱的Sobic.002G166150以及拟南芥的(RESISTANCE TO FUSARIUM OXYSPOR UM 1)基因属同源基因, 它是一类编码细胞壁关联受体激酶[9]。迄今, 除了抗褐锈病的Bru1和抗黄锈病G1标记外甘蔗中还报道了5个抗花叶病和11个抗黑穗病的DNA标记[10], 1个主效的抗甘蔗黄叶病基因位点[11], 但都仅限于抗性位点的发现, 尚未开发成可用的分子标记, 难以用于甘蔗抗病基因的快速鉴定和抗病种质的高效筛选。

目前, 国外甘蔗杂交育种计划中, Bru1标记常常被用于评估甘蔗种质资源和杂交后代无性系的褐锈病抗性[6]。但是, 关于甘蔗黄锈病抗性标记的应用, 除了纳入美国的育种计划外, 其他国家都还未有深入的研究, 也尚未有相关研究结果的报道。在我国, 甘蔗黄锈病是一种新发现的甘蔗真菌病害[6], 但关于甘蔗种质资源中抗黄锈病基因的分子检测未见其他报道。为深入了解我国和世界上重要的甘蔗栽培品种、野生种和近缘属中的抗黄锈病基因的分布状况, 并阐述抗病候选基因的起源及进化关系, 本研究拟采用抗黄锈病标记G1对中国及世界范围内重要的甘蔗栽培品种、野生种及近缘属材料, 进行抗黄锈病的分子检测, 进而对该标记扩增的代表性片段进行克隆测序、功能注释和聚类分析。旨在为国内外甘蔗种质资源的黄锈病抗性鉴定积累技术和经验, 为甘蔗对黄锈病抗性的起源和演化研究奠定基础, 最终为甘蔗抗黄锈病的分子育种和抗性基因的功能鉴定提供重要的研究基础和科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

用于黄锈病抗性分子检测的甘蔗栽培品种、野生种和近缘属种质总共204份, 其中包括170份栽培品种、28份甘蔗属材料(割手密种、大茎野生种和热带种)和6份近缘属(蔗茅属、芒属和河八王属)种质。国内甘蔗品种124份, 来自8个不同育种机构, 包括四川6份、江西1份、台湾15份、海南13份、福建9份、广西47份、云南10份和广东23份; 国外甘蔗品种46份, 其中美国30份, 其他国家16份。详见附表1和附表2。所有材料都来自国家甘蔗种质资源圃(National Germplasm Repository of Sugarcane)。

1.2 蛋白组数据的获取

从法国农业研究所甘蔗基因组中心(http://sug-arcane-genome.cirad.fr/)直接获得甘蔗栽培品种单倍体R570蛋白组数据。高粱蛋白组数据来源于网址(https://phYuetang ozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html), 拟南芥的蛋白组数据库来源于网址(https://www.arabidopsis. org/download/index-auto.jsp?dir=/download_files/Proteins)。菠萝的蛋白组数据库来源于网址(http://pineapple. angiosperms.org/pineapple/html/download.html)。拟南芥的基因(ID: AT1G21270.1-AtWAK2, AT1G 21250.1-AtWAK1(PRO25), AT1G79670.1-AtWAKL22, RFO1)来源于Zhang等[12]的报道。水稻的基因(ID: LOC_Os04g51040.1)和基因(ID: LOC_Os09g38850.1)分别来自孙俪静等[13]和Wang等[14]的报道。

1.3 黄锈病抗性标记G1的PCR扩增和分析

1.3.1 引物合成 依据Yang等[1]开发的黄锈病抗性标记G1方法对所选的204份甘蔗栽培品种、野生种及近缘属种质进行检测。G1标记上游引物为5'-ACCATGGAAATCCATACGuitangC-3', 下游引物为5'-GGCCAACACTTAGGCCAATA-3'。由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。G1标记预期扩增产物长度为911 bp。

1.3.2 DNA提取和PCR扩增体系 采用CTAB法[15]从蔗叶中提取基因组DNA。PCR的反应体系配置参考端木卜文等[16]的方法, 即每25 μL反应体积中含有DNA模板2 μL、上游和下游引物各(10 μmol L–1) 0.5 μL、ddH2O 9.5 μL、2×Plus Master Mix (Dye) 12.5 μL, 其中2×Plus Master Mix (Dye)试剂购自北京康为世纪生物科技有限公司。所有扩增均在T100 Thermal CYachengler (Bio-Rad Research, USA)扩增仪上进行。PCR反应参照Yang等[1]建立的扩增程序, 94℃预变性5 min; 95℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸45 s, 35个循环; 最后在72℃下延伸5 min, 4℃保存。所有PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。100 bp DNA Ladder (100~1500 bp)购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.4 黄锈病抗性标记G1候选基因的克隆、测序和鉴定

1.4.1 扩增产物的回收、克隆与测序 利用2%琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物, 挑选差异性扩增条带, 胶回收目标DNA片段, 纯化后, 连接到pMD18-T载体上, 从每个连接转化的反应板上挑取5个阳性克隆, 扩增培养后由生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序。

1.4.2 细胞壁连接的类受体激酶WAK的鉴定

以高粱细胞壁关联的受体激酶(WAK) Sobic. 002G166150的蛋白为种子序列, 进行本地BlastP比对甘蔗栽培品种(R570)单倍体蛋白组数据库, 蛋白质筛选标准e-value值为10-2, 相似性为40%以上,获得与高粱Sobic.002G166150的相似度较高蛋白序列。

1.5 生物信息学分析方法和工具

利用 Pfam (http://pfam.janelia.org/)和SMART (http://smart.emblheidelberg.de/)在线软件预测保守结构域, 确保其 N-末端含有一个或多个细胞壁GUB_WAK_bind结构域、跨膜域、C-末端 Pkinase结构域。采用DNAMAN 6.0将水稻、拟南芥、高粱和甘蔗的WAK蛋白进行多序列比对, 找出保守的氨基酸残基。采用MEME在线软件(http://meme- suite.org/tools/meme)预测WAK蛋白的保守结构域。通过Clustal W软件对4个物种的WAK蛋白的氨基酸序列进行比对, 将比对结果运用MEGA7.0软件 (http://www.megasoftware.net/)利用最大似然法(Maximum Likelihood)构建系统进化树, 执行参数为 Poission 模式(Dayhoff model)、全部删除(complete deletion)和1000次重复有根树(Bootstrap method 1000)。选用Adobe Illustrator CS6软件进行加工和处理图片。

2 结果与分析

2.1 甘蔗栽培品种抗黄锈病标记G1的PCR检测

基于抗黄锈病标记G1, 对国内外甘蔗栽培品种共170份进行PCR检测发现, 中国栽培品种124份, 含有抗性标记G1的有83份(占比66.9%); 国外栽培品种46份, 含有抗性标记G1的有31份(占比67.4%), 其中来自美国的30个甘蔗栽培品种中, 含有抗性标记G1的有21份(占比70%), 阳性率高于中国甘蔗栽培品种。

2.2 甘蔗野生种与近缘属材料的抗黄锈病标记G1的PCR检测

对28份甘蔗属野生种进行抗黄锈病标记G1检测发现, 含有抗性标记的有15份, 阳性率为53.6%。甘蔗属野生种的检测结果分别是印度种(1/3,HATUNI)、中国种(1/3, 桂林竹蔗)、大茎野生种(2/6, MOL-6081和福建大野)、割手密种(11/11)呈现阳性结果, 但是占甘蔗栽培品种染色体组70%~80%的热带种没有检测到911 bp的阳性结果。利用G1标记对6份甘蔗a近缘属材料进行检测发现, 蔗茅属(1/2,贵州78-2-12)、河八王属(1/2,广西89-13)呈现阳性结果, 而芒属的2个材料检测结果为阴性。表明, G1标记关联的候选基因也分布于甘蔗野生种和近缘属材料中, 其中所有参试割手密种质G1检测结果都为阳性。

1: HoCP 94-806; 2: 赣南99-591; 3: 粤糖00-236; 4: 桂糖05-827; 5: 桂糖00-257; 6: 崖城97-46; 7: 湛蔗80-101; 8: CP 67-412; 9: 桂糖05-322; 10: 崖城94-46; 11: 桂糖08-278; 12: 桂糖00-245; 13: CP 89-1509; 14: 桂糖05-3846; 15: 桂糖29; 16: 崖城93-26; 17: CP 72-2086; 18: 崖城94-30; 19: CP 92-1213; 20: HoCP 92-624; 21: 桂糖05-2605; 22: 崖城96-24; 23: 湛蔗22; 24: 崖城99-6; M:100 bp DNA ladder。

1: HoCP 94-806; 2: Gannan 99-591; 3: Yuetang 00-236; 4: Guitang 05-827; 5: Guitang 00-257; 6: Yacheng 97-46; 7: ZZ 80-101; 8: CP 67-412; 9: Guitang 05-322; 10: Yacheng 94-46; 11: Guitang 08-278; 12: Guitang 00-245; 13: CP 89-1509; 14: Guitang 05-3846; 15: Guitang 29; 16: Yacheng 93-26; 17: CP 72-2086; 18: Yacheng 94-30; 19: CP 92-1213; 20: HoCP 92-624; 21: Guitang 05-2605; 22: Yacheng 96-24; 23: ZZ 22; 24: Yacheng 99-6; M:100 bp DNA ladder.

2.3 G1标记PCR扩增产物序列的获得与分析

利用G1标记检测甘蔗种质过程中发现, 在部分种质扩增到了与目标条带(911 bp)不一致的非特异性条带, 如图2中的泳道2、4、6、11、13、19、20所代表的分别为广西89-13、印度1号、LA-purple、桂林竹蔗、四川79-1-26、福建89-1-1和福建大野。通过比较分析, 挑选12个具有代表性的差异条带进行胶回收和克隆测序, 每个样品均挑选5个阳性克隆测序。从12个甘蔗种质中得到了34个候选基因的单倍型, 不同基因型种质有1~5个等位基因, 扩增片段大小范围分别是678~693、911~914、1073~1075和1303~1505 bp (图3)。聚类结果表明, G1标记所在基因型可以分为3组, 第1组来源于割手密种和大茎野生种; 第2组来源于大茎野生种、热带种和河八王属, 其中热带种LA-purple的678 bp片段和河八王属的693 bp片段间亲缘关系较近, 可能由共同祖先分化而来; 第3组是来源于割手密种、大茎野生种和栽培品种, 核酸片段间相似度较高, 多态性低, 表明甘蔗栽培品种的抗性候选基因主要来源于割手密种。

2.4 G1标记候选基因编码蛋白WAK的鉴定和结构特征分析

将2.3中克隆得到的所有DNA片段都在NCBI上进行序列比对发现, 所有克隆片段基因都比对到高粱XM_002459982.2基因上, 通过高粱上的注释发现它是一种细胞壁的类受体激酶基因。同时, G1标记所在基因与拟南芥的基因属于直系同源基因[9], 表明本研究的G1标记的候选基因也可能是一类水平抗性基因, 不是种间特异性抗性基因。

1: 贵州78-2-12; 2: 广西89-13; 3: 广东64号; 4: 印度1号; 5: 广西79-8; 6: LA-purple; 7: 路达仕; 8: 云南95-19; 9: Katha; 10: 云南 95-35; 11: 桂林竹蔗; 12: 四川79-2-11; 13: 四川79-1-26; 14: 贵州78-2-28; 15: 贵州78-1-11; 16: 广东30号; 17: 广东21号; 18: 福建89-1-16; 19: 福建89-1-1; 20: 福建大野; 21: NG 77-004; 22: 57NG208; 23: 云南大野; 24: 51NG3; M: 100 bp DNA ladder。

1: Guizhou 78-2-12; 2: Guangxi 89-13; 3: Guangdong 64; 4: Yindu 1; 5: Guangxi 79-8; 6: LA-purple; 7: Loethers; 8: Yunnan 95-19; 9: Katha; 10: Yunnan 95-35; 11: Guilinzhuzhe; 12: Sichuan 78-2-11; 13: Sichuan 79-1-26; 14: Guizhou 78-2-28; 15: Guizhou 78-1-11; 16: Guangdong 30; 17:Guangdong 21; 18: Fujian 89-1-16; 19: Fujian 89-1-1; 20: Fujiandaye; 21: NG77-004; 22: 57NG208; 23: Yunnandaye; 24: 51NG3; M: 100 bp DNA ladder.

将高粱XM_002459982.2与Sobic.002G166150的蛋白序列进行比较发现, 两者相似性为96.8%, 前者蛋白序列的N端比后者仅多了30个氨基酸残基,可能是由不同注释方法引起的差异。以高粱Sobic.002G166150的蛋白为种子序列, 进行本地BlastP比对甘蔗栽培品种(R570)单倍体蛋白组数据库, 得到3个相似度较高的蛋白序列Sh_208E10_ p000080 (相似度53%)、Sh_239A14_p000040 (相似度49.5%)和Sh_222N03_p000030 (相似度43.4%) (命名为ScWAK1、ScWAK2和ScWAK3)。通过Pfam软件分析发现, 3个蛋白都具有典型的植物细胞壁关联激酶结构特征, 包括细胞壁受体结构(GUB_ WAK_bind) 的胞外域、跨膜域和具有激酶活性的胞内域(图4)。再与拟南芥(WAK2, PRO25和RFO1)、水稻(OsDEES1)已鉴定的植物细胞壁关联激酶进行蛋白序列比对(图5)发现, Sh_239A14_ p000040蛋白在跨膜区的前端有EGF重复结构域, 在胞内域也具有典型的ATP结合基序和激酶活性位点。

2.5 甘蔗G1标记候选蛋白与其他物种中已鉴定WAK蛋白的聚类分析

聚类分析结果表明, 3个甘蔗的WAK蛋白序列和高粱、水稻聚类为一组, 表明它们可能具有相似功能(图6)。而拟南芥的2个成员(WAK2和PRO25)为一组, 且二者是由串联重复事件产生。但水稻的OsWAK50和拟南芥的RFO1聚为一组, 表明二者可能起源于单双子叶分化之前, 序列相似性仅为32.2%。MEME软件的预测结果显示, 来自栽培品种R570的Sh_208E10_p000080、Sh_239A14_p000040和Sh_222N03_p000030蛋白和高粱、水稻的WAK蛋白一样具有10个基序, 除了OsDEES1蛋白少了C端的一个motif 5, 其余2组的4个WAK蛋白有9个完整的基序。根据Wang等[14]研究结果, 水稻中有4个OsDEES1的旁系同源基因, 都具有完整的C端, 表达谱分析表明, OsDEES1及旁系同源基因有不同的表达模式, 导致不同功能。综上分析, 本研究推测甘蔗栽培品种的3个ScWAK蛋白也可能与OsDEES1具有相似的功能。

为了进一步了解WAK蛋白在物种间的进化关系, 从拟南芥的蛋白数据库得到了21个WAKL蛋白[12], 水稻中获得125个WAK/WAKL[17], 甘蔗栽培品种R570中得到了134个, 菠萝蛋白数据库中鉴定到20个, 高粱中鉴定了73个。通过生物信息分析发现, 在单双子叶物种中, WAK/WAKL基因数量存在显著差异, 且单子叶植物的WAK基因多于双子叶的拟南芥, 但缺少ρ全基因复制事件的菠萝WAK基因数目为20, 与拟南芥相差不大, 这表明WAK基因数量的扩增现象可能发生在ρ全基因组复制事件之后。

3 讨论

现代甘蔗栽培品种是热带种(L., 2=80,=10)和割手密种(L., 2=40~128,=8)杂交产生的杂交种, 再与热带种进行回交产生杂种后代, 具有遗传背景高度杂合、多倍体和非整倍体性, 且染色体数目在100~130之间[18]。割手密种具有耐寒性、抗病性和再生能力强等优良特性, 经“高贵化”育种方法将甘蔗野生种质血缘引入甘蔗栽培品种[19]。甘蔗栽培品种中来源割手密种的染色体数目大约占10%~15%, 种间重组的染色体数目大约占5%~10%。甘蔗黄锈病是近年来发生在蔗区的一种新的甘蔗流行性病害, 感病甘蔗品种的产量损失严重, 培育抗病品种是防控该病害最有效的策略。甘蔗育种从花穗杂交到品种审定往往需要12年左右时间, 具有投入大、周期长等缺点。因此, 了解甘蔗育种亲本和其他野生或近缘属种质资源中抗黄锈病基因的分布状况, 不仅有利于筛选抗性亲本和科学组配杂交组合, 还能提高抗黄锈病分子育种的效率, 对于培育优良抗病品种、高效地防控甘蔗病害具有重要意义。Yang等[1]利用群体遗传学方法证实, 甘蔗黄锈病的抗性是由多个基因控制, 借助高密度遗传图谱, 定位到3个抗黄锈病基因位点(qORR109、qORR102和qORR4), 分别解释表型变异的58%、8%和12%, 其中前2个位点对抗病性具有正效应, 而后1个位点为负效应。此外, Yang等[1]还对应设计了96对SSR标记和61对基因特异性标记, 经反复测试, 开发了qORR109位点特异性高的G1标记, 该标记与黄锈病抗性存在显著的关联。根据候选基因编码的蛋白序列比对后发现, G1标记的候选基因编码的蛋白序列与高粱Sobic. 002G166150的蛋白序列相似度最高, 属于细胞壁关联激酶类, 推测G1的候选基因可能是一类水平抗性基因, 不是种间特异性抗性基因。

ED: 胞外域; TM: 跨膜域; ID: 胞内域。

ED: extracellular domain; TM: transmembrane region; ID: intracellular domain; EGF2: EGF2-like region; EGF-Ca: calcium-binding EGF-like domain.

EGF1: 表皮生长因子重复序列; EGF2: 钙结合类表皮生长因子结构域; TM: 跨膜域; ATP-B: ATP结合位点; KAS: 激酶活性位点。

EGF1: EGF1-like region; EGF2: calcium-binding EGF-like domain; TM: transmembrane region; ATP-B: ATP-binding region; KAS: kinase active site are underlined.

本研究中, 利用G1标记对204个甘蔗栽培品种、野生种和近缘属种质的检测结果表明, 我国甘蔗栽培品种中抗性标记检出率为66.9%, 国外的甘蔗栽培品种检出率为67.4%。检出结果与Yang等[1]在F1分离群体中检测结果(检出率为65.8%)基本类似。我们推测, 黄锈病的抗性候选基因广泛分布于大多数甘蔗栽培品种中, 这可能是甘蔗黄锈病相对其他甘蔗病害发病面积相对较小的主要原因之一。但是, 端木卜文等[16]在180份甘蔗材料中检测到G1标记, 占比5.6%, 与我们的甘蔗栽培品种中占比66.9%相比, 结果相差较大。

野生种是现代甘蔗栽培品种中抗病基因的重要来源[20], 亟须对其进行抗病鉴定、筛选优良抗源并进一步挖掘抗病基因资源, 最终为抗病分子育种提供重要抗源材料。同时, 我们基于抗病诊断标记G1, 追踪甘蔗野生种质中其标记候选基因的起源和进化, 对深入分析甘蔗抗病遗传基础和选育优良抗病品种具有重要价值。本研究中, 对34份甘蔗野生种及近缘属材料进行抗黄锈病标记G1检测发现, 含有抗性标记的有17份(阳性率为50%), 其中28份甘蔗属材料中检测到抗性标记的有15份(阳性率为53.6%)、6份甘蔗近缘属中有2份材料(来自蔗茅属和河八王属)呈现阳性结果。表明G1标记的候选基因在甘蔗野生种和近缘属中都广泛分布, 其中割手密种质中抗性候选基因占最多, 这与前人研究中针对甘蔗种质资源中褐锈病的抗源分析结果基本一致[21]。

运用G1标记扩增抗性基因的单倍型进行聚类分析表明, 34个扩增基因片段按大小, 可分为4类, 其中678~693 bp扩增基因片段来源于热带种LA- purple和割手密种广西89-13, 而1073~1075 bp来源于大茎野生种Mol-6081, 三者都同属于聚类分析的第2组。911~914 bp扩增基因片段来源于割手密种四川79-1-26和福建大茎野生种、中国种和栽培品种, 都同属于聚类分析的第3组, 也进一步阐明甘蔗栽培品种中的抗性基因主要来源割手密种。1303~1305 bp扩增基因片段来源于割手密种四川79-1-26和大茎野生种Mol-6081, 而1500 bp扩增基因片段来源于大茎野生种Mol-6081, 且2种扩增片段类型亲缘关系较近, 都属于聚类分析的第1组。从甘蔗栽培品种G1标记的扩增结果来看(图1), 抗性基因片段主要有3种类型, 一种是G1标记的候选基因扩增片段为911 bp, 另外2种分别为大约1300 bp和1500 bp, 即使没有扩增911 bp候选基因片段, 也有1300 bp和1500 bp扩增片段。表明, 除了来源于割手密种的染色体外, 甘蔗栽培品种也具有来源于大茎野生种的染色体片段。热带种被认为是从大茎野生种家驯化而来, 不仅两者具有相同的起源中心(新几内亚)和染色体基数=10[22], 而且利用SSR分子标记技术对甘蔗属进行聚类分析的研究证实, 热带种与大茎野生种具有较近的亲缘关系[23], 本研究结果从侧面也证明了其结论的准确性。

Verica等[24]利用WAK1的蛋白序列对拟南芥和水稻数据库进行比对, 找到一类与WAK结构相似的WAK类似基因(WAK like genes, WAKLs), 除了少数基因缺少某些序列外(跨膜域和信号肽等), 大部分基因具有WAK的典型结构特征, 且水稻中WAKL基因的数量远多于拟南芥[17]。根据He等[25]研究结果, 在拟南芥1号染色30 kb内鉴定到了5个高度相似的WAK基因(依次WAK4、WAK5、WAK3、WAK1和WAK2), 同时, WAKL1-7基因间都是成簇排列, 表明WAK/WAKL基因家族都发生了多次串联复制事件。本研究中, 甘蔗栽培品种R570的基因组是基于高粱基因组组装而成的一套单倍体基因组, 仅有4660 BAC大片段序列, 鉴定了134个WAK/WAKL蛋白, 目前尚无法确定编码这些蛋白的基因复制类型。将甘蔗、高粱、水稻与拟南芥的WAK蛋白进行序列比对发现, 与拟南芥蛋白WAK相比, 来自C4作物高粱和甘蔗的WAK蛋白N端胞外域都具有额外的140氨基酸, 可能存在其他特殊的功能, 而C端的氨基酸数量与拟南芥、高粱的WAK蛋白的氨基酸基本一致, 但该结果与Wang等[14]报道的水稻OsDEES1分析结果不一致。需要特别注意的是, WAK蛋白在胞内激酶结构域相似性较高(69.1%), 表明该家族比较保守, 在细胞内可能传递或介导相似的信号通路; 但是胞外域同源性就很低, 大约27.3%~33.6%之间, 表明这类蛋白的胞外域结构变异大, 可以结合不同类型的配基, 来应答不同的环境信号, 分析结果与He等[25]报道相一致。

甘蔗褐锈病和黄锈病抗性都属于数量性状, 受多基因控制[1,21,26]。前人根据主效基因的定位结果, 分别建立了与甘蔗褐锈病和黄锈病抗性紧密连锁的分子标记(R12H16、9O20-F4和G1)及其检测方法[1,11]。研究表明, 褐锈病抗性标记检测与表型鉴定之间的关联分析准确性较低, 即表型鉴定为抗病的甘蔗植株其分子标记检测结果可能为阴性[26], 这些结果暗示除了外, 还有其他抗性基因的存在[20,26]。造成这些结果的原因是已经建立的甘蔗遗传图谱密度较低[1,11], 但数量性状抗性则由多个基因位点控制[1,21,26], 因此需要进一步增加遗传图谱密度, 找出所有控制抗性的基因位点, 并建立多个抗性位点的标记检测方法, 这种情况下分子标记检测与表型鉴定之间的关联分析才显得更有意义[26]。本研究中, 黄锈病抗性属于多基因控制, 仅进行单一分子标记检测与表型鉴定的关联验证, 意义和价值不大。进一步的研究, 需要在加密甘蔗遗传图谱的基础上, 获得控制甘蔗黄锈病抗性的所有基因位点并开发出系列标记, 进而将所有这些标记的检测结果与表型鉴定结果相互验证、相互映衬, 以获得真实可靠的甘蔗黄锈病抗性鉴定结果, 为甘蔗抗黄锈育种奠定良好的基础。

4 结论

本研究揭示了G1标记的候选基因广泛分布于甘蔗栽培品种、野生种和近缘属, 其中割手密种含有该基因比例最高。基于比较基因组学, 从甘蔗栽培品种R570蛋白数据库中鉴定到3个与候选抗黄锈病WAK基因编码蛋白相似度较高的蛋白, 蛋白结构特征和保守结构域分析表明, 该蛋白为一种细胞壁连接的类受体激酶。聚类分析揭示G1标记扩增的候选基因可分为3组, 第1组来源于割手密种和大茎野生种; 第2组来源于于大茎野生种、热带种和河八王属; 第3组来源于割手密种、大茎野生种和栽培品种, 推测甘蔗栽培品种的G1标记候选基因主要来源于割手密种。以上结果为甘蔗抗黄锈病基因的图位克隆及抗性溯源甚至抗性分子机制的解析积累了重要的理论和实践基础。

附表 请见网络版: 1) 本刊网站http://zwxb.China crops.org/; 2) 中国知网http://www.cnki.net/; 3) 万方数据http://c.wanfangdata.com.cn/Periodical-zuowxb. aspx。

[1] Yang X, Islam M S, Sood S, Maya S, Hanson E A, Comstock J, Wang J. Identifying quantitative trait loci (QTLs) and developing diagnostic markers linked to orange rust resistance in sugarcane (spp.).,2018, 9: 350.

[2] Ryan C C, Egan B T. CHAPTER XIII-rust. In: Ricaud C, Egan B T, Gillaspie A G, Hughes C G, eds. Diseases of SugarcaneAmsterdam: Elsevier, 1989. pp 189–210.

[3] Braithwaite K S, Croft B J, Magarey R C, Scharaschkin T. Phylogenetic placement of the sugarcane orange rust pathogenin a historical and regional context.,2009, 38: 380–388.

[4] Elmhirst J F, Verma N. First report of anthracnose of salal caused by colletotrichum acutatum in British Columbia.,2007, 92: 175–175.

[5] Barbasso D, Jordão H, Maccheroni W, Boldini J, Bressiani J, Sanguino A. First report of, causal agent of orange rust of sugarcane, in Brazil.,2010, 94: 1170–1170.

[6] 王晓燕, 李文凤, 黄应昆, 张荣跃, 单红丽, 罗志明, 尹炯. 云南蔗区首次发现由屈恩柄锈菌引起的甘蔗黄锈病. 中国农学通报,2015, 31(18): 273–277. Wang X Y, Li W F, Huang Y K, Zhang R Y, Shan H L, Luo Z M, Yin J. First report of orange rust of sugarcane caused byin Yunnan sugarcane field., 2015, 31(18): 273–277 (in Chinese with English abstract).

[7] Le Cunff L, Garsmeur O, Raboin L M, Pauquet J, Telismart H, Selvi A, Grivet L, Philippe R, Begum D, Deu M, Costet L, Wing R, Glaszmann J C, D’Hont A. Diploid/polyploid syntenic shuttle mapping and haplotype-specific chromosome walking toward a rust resistance gene () in highly polyploid sugarcane (2approximately 12approximately 115).,2008, 180: 649–660.

[8] Asnaghi C, Roques D, Ruffel S, Kaye C, Hoarau J Y, Télismart H, Girard J C, Raboin L M, Risterucci A M, Grivet L, D’Hont A. Targeted mapping of a sugarcane rust resistance gene () using bulked segregant analysis and AFLP markers.,2004, 108: 759–764.

[9] Diener A C, Ausubel F M. RESISTANCE TO, a dominantdisease-resistance gene, is not race specific.,2005, 171: 305–321.

[10] Wei X, Jackson P A, McIntyre C L, Aitken K S, Croft B. Associations between DNA markers and resistance to diseases in sugarcane and effects of population substructure.,2006, 114: 155–164.

[11] Costet L, Le Cunff L, Royaert S, Raboin L M, Hervouet C, Toubi L, Telismart H, Garsmeur O, Rousselle Y, Pauquet J, Nibouche S, Glaszmann J C, Hoarau J Y, D’Hont A. Haplotype structure aroundreveals a narrow genetic basis for brown rust resistance in modern sugarcane cultivars.,2012, 125: 825–836.

[12] Zhang S, Chen C, Li L, Meng L, Singh J, Jiang N, Deng X W, He Z H, Lemaux P G. Evolutionary expansion, gene structure, and expression of the rice wall-associated kinase gene family.,2005, 139: 1107–1124.

[13] 孙丽静, 张芊, 路铁刚, 孙颖. 利用酵母双杂交系统筛选水稻类受体激酶OsWAK50胞内域相互作用蛋白. 生物化学与生物物理进展, 2012, 39: 438–447. Sun L J, Zhang X, Lu T G, Sun Y. Screen of receptor-like kinase OsWAK50 intracellular interacting proteins by yeast two-hybrid system., 2012, 39: 438–447 (in Chinese with English abstract).

[14] Wang N, Huang H J, Ren S T, Li J J, Sun Y, Sun D Y, Zhang S Q. The rice wall-associated receptor-like kinase geneplays a role in female gametophte development.,2012, 160: 696–707.

[15] Murray M G, Thompson W F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA.,1980, 8: 4321–4326.

[16] 端木卜文, 黄郑辉, 吴小斌, 高小宁, 谢振文, 齐永文. 甘蔗(species hybrid)种质资源褐锈病和黄锈病抗性位点分子检测. 分子植物育种, 2019, 18: 2626–2632. Duan-Mu B W, Huang Z H, Wu X B, Gao X N, Xie Z W, Qi Y W. Molecular detection of resistance loci to brown rust and orange rust in sugarcane germplasm resources., 2019, 18: 2626–2632 (in Chinese with English abstract).

[17] Shiu S H, Karlowski W M, Pan R, Tzeng Y H, Mayer K F X, Li W H. Comparative analysis of the receptor-like kinase family inand rice.,2004, 16: 1220–1234.

[18] Hermann S R, Aitken K S, Jackson P A, George A W, Piperidis N, Wei X, Kilian A, Detering F. Evidence for second division restitution as the basis for 2+maternal chromosome transmission in a sugarcane cross.,2012, 187: 359–368.

[19] Piperidis G, Piperidis N, D’Hont A. Molecular cytogenetic investigation of chromosome composition and transmission in sugarcane.,2010, 284: 65–73.

[20] 李文凤, 王晓燕, 黄应昆, 张荣跃, 单红丽, 罗志明, 尹炯. 101份中国甘蔗主要育种亲本褐锈病抗性鉴定及基因的分子检测. 作物学报. 2016, 42: 1411–1416. Li W F, Wang X Y, Huang Y F, Zhang R Y, Shan H L, Luo Z M, Yin J. Identification of resistance to brown rust and molecular detection ofgene in 101 main sugarcane breeding parents in China.,2016, 42: 1411–1416.

[21] 李文凤, 王晓燕, 黄应昆, 张荣跃, 单红丽, 尹炯, 罗志明. 31份甘蔗野生核心种质资源褐锈病抗性鉴定及基因的分子检测. 作物学报,2015, 41: 806–812.Li W F, Wang X Y, Huang Y K, Zhang R Y, Shang H L, Yin J, Luo Z M. Identification of resistance to brown rust and molecular detection ofgene in 31 wild core sugarcane germplasms., 2015, 41: 806–812 (in Chinese with English abstract).

[22] D’Hont A, Ison D, Alix K, Roux C. Determination of basic chromosome numbers in the genusby physical mapping of ribosomal RNA genes.,2011, 41: 221–225.

[23] Brown J, Schnell R J, Power E, Douglas S. Analysis of clonal germplasm from fivespecies:,,,andA study of inter- and intra-species relationships using microsatellite markers.,2007, 54: 627–648.

[24] Verica J A, He Z H. The cell wall-associated kinase (WAK) and WAK-like kinase gene family.,2002, 129: 455–459.

[25] He Z H, Cheeseman I, He D, Kohorn B D. A cluster of five cell wall-associated receptor kinase genes, are expressed in specific organs of.,1999, 39: 1189–1196.

[26] Racedo J, Perera M F, Bertani R, Funes C, González V, Cuenya M I, D′Hont A, Welin B, Castagnaro A P.gene and potential alternative sources of resistance to sugarcane brown rust disease.,2013, 191: 429–436.

Molecular detection of G1 marker for orange rust resistance and analysis of candidate resistancegene in sugarcane

WANG Heng-Bo, CHEN Shu-Qi, GUO Jin-Long, and QUE You-Xiong*

Key Laboratory of Sugarcane Biology and Genetic Breeding (Fujian), Ministry of Agriculture and Rural Affairs / National sugarcane Engineering Technology Research, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian, China

Sugarcane orange rust is an important fungal disease caused byButler, which could lead to a reduction in sugarcane production and sugar content and cause serious losses to the sugarcane industry in worldwide. In this study, the molecular marker G1 was used to detect orange rust resistance genes in cultivars, ancestral species and the relatedofin the world. The representative amplified bands were cloned, sequenced, functionally annotated, and clustered, and the origin and evolution of resistance genes was then analyzed. The results showed that 83 and 34 were detected with G1 marker, accounting for 66.9% and 67.4% in 124 Chinese and 46 foreign sugarcane cultivars, respectively. Among 34 sugarcane ancestral species and the related genus of, 17 were detected by G1 marker, accounting for 50%, of which the highest percentage (100%) was in. Functional annotation revealed that G1 target gene encoded a wall-associated receptor-like kinase (WAK), and three proteins with high similarity were identified from the haploid proteome database of sugarcane cultivars. These proteins all contain the extracellular domain, transmembrane domain and intracellular domain with kinase activity of typical cell wall receptor structures. Phylogenetic analysis of nucleotide sequences clearly showed the origin and evolution of the candidate resistancegenes. Specifically, thegenes amplified by G1 marker could be divided into three groups. The first group is fromand. The second group is from,and. The third group is from,,and cultivars. These results provided an important support for breeding of sugarcane cultivars resistant to orange rust, and lay a foundation for further analysis of molecular mechanism of resistance genes.

detection; molecular markers; wall-associated receptor-like kinase; orange rust; sugarcane

10.3724/SP.J.1006.2021.04131

本研究由引进国际先进农业科学技术计划(948计划)项目(2014-S18), 国家现代农业(糖料)产业技术体系建设专项(CARS-17)和福建农林大学校科技发展专项(KFA18025A)资助。

This study was supported by the Program of Introducing International Super Agricultural Science and Technology (948 Program) (2014-S18), the China Agricultural (Sugar Crop) Research System (CARS-17), and the Fujian Agriculture and Forestry University Science and Technology Development Special Fund (KFA18025A).

阙友雄, E-mail: queyouxiong@126.com

E-mail: wanghengbo_0354@126.com

2020-06-18;

2020-10-14;

2020-11-02.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20201030.1639.006.html